儲玉雙 李紅英 黃小紅

摘要：試驗(yàn)應(yīng)用復(fù)合碘制劑、2%戊二醛消毒液、優(yōu)氯凈消毒粉（二氯異氰尿酸鈉）、苯扎溴銨四種常用的化學(xué)消毒劑對豬2型圓環(huán)病毒殺滅效果進(jìn)行研究，采用病毒滴定、中和劑鑒定及病毒滅活試驗(yàn)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，二氯異氰尿酸鈉的殺滅效果最好，其次是戊二醛，復(fù)合碘制劑也有一定的殺毒作用，苯扎溴銨消毒液的殺滅效果最差，建議將二氯異氰尿酸鈉和戊二醛作為控制豬2型圓環(huán)病毒的消毒劑，可有效防止豬2型圓環(huán)病毒的傳播。

關(guān)鍵詞：化學(xué)消毒劑;豬2型圓環(huán)病毒;殺滅效果

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2018）12-0005-02

豬圓環(huán)病毒（PCV）按照致病性的有無分為1型和2型，PCV1被認(rèn)為不具備致病性，具有致病性的

PCV2被認(rèn)為同豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）等疫病有關(guān)[1]。豬圓環(huán)病毒是無囊膜病毒，也稱裸病毒，是目前發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物疾病中最小的病毒，通常裸病毒很難消滅，所以一定要使用有效消毒劑才能殺滅裸病毒。對該類病毒，許多消毒劑如酚制劑、陽離子表面活性劑、季銨鹽類等的使用效果不理想或沒有效果。目前市場上真正稱得上是廣譜高效消毒劑的有碘制劑、甲醛、戊二醛及二氯異氰尿酸鈉（DCCNa）等，能夠殺滅各種細(xì)菌、芽孢、真菌、囊膜病毒和非囊膜病毒等，試驗(yàn)選擇復(fù)合碘制劑、2%戊二醛消毒液、優(yōu)氯凈消毒粉（二氯異氰尿酸鈉，DCCNa）、苯扎溴銨四種消毒劑來殺滅豬2型圓環(huán)病毒，比較其消毒效果，旨在為豬2型圓環(huán)病毒的預(yù)防提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 毒株與細(xì)胞

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、保存和提供。不含PCV1和PCV2的豬腎細(xì)胞PK（15）由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代保存。

1.2? 主要試劑

復(fù)合碘制劑、戊二醛消毒液、優(yōu)氯凈消毒粉（5%二氯異氰尿酸鈉）、苯扎溴銨四種消毒劑購買自江西匯康實(shí)業(yè)有限公司。甘氨酸為河南特康生物科技有限公司，吐溫80為Sigma產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)試劑中DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司。無菌胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。復(fù)合碘制劑和優(yōu)氯凈消毒粉（5%二氯異氰尿酸鈉）的中和劑為0.1 mol/L硫代硫酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）;戊二醛消毒液的中和劑為0.3%吐溫80+0.1%甘氨酸的PBS;苯扎溴銨為季銨鹽類消毒劑，它的中和劑為卵磷脂+吐溫80+組氨酸[2]。

1.3? 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋，芬蘭百得實(shí)驗(yàn)室儀器（中國）有限公司;超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司;振蕩培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠;培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠;電子天平，YP202N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;96孔培養(yǎng)板。

1.4? 方法

1.4.1? 病毒滴定的方法? 將PCV2病毒株用細(xì)胞維持液（1%血清的DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行10倍系列稀釋（101～106），分別接種于PK（15）細(xì)胞（96孔培養(yǎng)板）中，每個(gè)稀釋度接種8孔，置于37 ℃、50% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變的結(jié)果，連續(xù)觀察3 d，按Reed-Muench法計(jì)算該病毒的半數(shù)細(xì)胞感染劑量（TCID50）[3]，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.2? 中和劑鑒定試驗(yàn)? 試驗(yàn)共分為6組，第1-3組為中和劑，后3組為陰性對照，分別為細(xì)胞維持液、標(biāo)準(zhǔn)硬水、PBS，混勻接種3～4 h后觀察細(xì)胞生長情況。

1.4.3? 病毒滅活試驗(yàn)? 用標(biāo)準(zhǔn)硬水將消毒劑按待測濃度的1.5倍稀釋成試驗(yàn)用的消毒劑，將0.5 mL待測消毒劑置（20±1） ℃水浴30 min，再吸加0.5 mL各病毒懸液，混勻。待作用至試驗(yàn)規(guī)定的滅活病毒時(shí)間（5、10、20 min），立即取出0.1 mL，加入含0.9 mL中和劑混勻，作用10 min，作系列稀釋后，吸取樣液，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種4孔;陽性對照組，用0.6 mL無菌去離子水代替消毒劑，將細(xì)胞培養(yǎng)板置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，吸附1～2 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)液體棄去，在板內(nèi)加入細(xì)胞維持液，37 ℃二氧化碳孵箱培養(yǎng)5 d，分別測定不同濃度消毒劑、不同作用時(shí)間對PCV2的殺滅效果，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4? 豬圓環(huán)病毒耐藥性試驗(yàn)? 將400 mg/L復(fù)合碘溶液、250 mg/L戊二醛消毒液、150 mg/L有效氯的復(fù)方二氯異氰尿酸鈉及 40 g/L的苯扎溴銨溶液間隔30、90、120 d使用，分組別長期作用豬圓環(huán)病毒，對兔進(jìn)行靜脈注射，判斷各組別的豬圓環(huán)病毒耐藥性產(chǎn)生的時(shí)間及變化情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 中和劑對PK（15）細(xì)胞生長狀況的影響

中和劑對PK（15）細(xì)胞生長狀況的影響見圖1。由圖1可知，各中和劑沒有影響細(xì)胞的生長，與對照組相當(dāng)，表明選用的中和劑及形成的中和產(chǎn)物對PK（15）細(xì)胞無毒害作用。

2.2? 四種消毒劑對PCV2的殺滅效果

結(jié)果表明，以含400 mg/L復(fù)合碘溶液對豬圓環(huán)病毒作用5 min，滅活率為100%;以200 mg/L復(fù)合碘溶液作用10 min，滅活率為99.99%（表1）。

250 mg/L戊二醛消毒液、150 mg/L DCCNa及40 g/L的苯扎溴銨溶液與豬圓環(huán)病毒作用5 min，滅活率均可達(dá)到100%（表2、表3、表4）。

2.3? PCV2耐藥性

豬圓環(huán)病毒耐藥性研究結(jié)果表明，250 mg/L戊二醛和150 mg/L DCCNa抗毒性強(qiáng)，體溫?zé)o變化，120 d未產(chǎn)生耐藥性;400 mg/L復(fù)合碘有一定的抗毒性，120 d使用較易產(chǎn)生耐藥性;40 g/L的苯扎溴銨抗毒差，120 d使用更易產(chǎn)生耐藥性（表5）。

3? 小結(jié)

四種常用消毒劑在相同的濃度和試驗(yàn)條件下（溫度、相對濕度、酸堿度等）殺滅豬圓環(huán)病毒，以DCCNa的殺滅效果最好，其次是戊二醛，復(fù)合碘制劑也有一定的殺滅作用，苯扎溴銨消毒液的殺滅效果最差。四種消毒劑的消毒效果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[4]，建議將DCCNa和戊二醛作為控制豬圓環(huán)病毒的消毒劑。該方法與秦濤等[5]的研究方法近似，結(jié)果滿意。

中和劑鑒定試驗(yàn)表明，四種中和劑安全可靠，無毒副作用，中和劑對PCV2在PK（15）細(xì)胞中的增殖無顯著抑制作用。文獻(xiàn)研究表明決定中和劑選擇結(jié)果好壞的關(guān)鍵不在于試驗(yàn)病毒 ，而在其宿主培養(yǎng)細(xì)胞， 即能否選出對試驗(yàn)細(xì)胞無毒或毒性較小的中和劑和中和產(chǎn)物[6]。

PCV2耐藥性研究結(jié)果表明，戊二醛和DCCNa抗毒性強(qiáng)，復(fù)合碘有一定的抗毒性，苯扎溴銨抗毒性差。該結(jié)果與秦秀慧等[7]的戊二醛復(fù)合消毒劑對豬病病毒殺滅效果的研究結(jié)果相一致。經(jīng)查詢文獻(xiàn)資料，關(guān)于消毒劑對豬圓環(huán)病毒消毒效果及耐藥性的研究較少，本研究可為養(yǎng)豬場預(yù)防疾病及消毒劑選擇提供參考。

參考文獻(xiàn)：

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[3] REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].American Journal of Hygiene，1938，27：493-497.

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[5] 秦? 濤，汪川韋，石寶蘭，等.四種常用消毒劑對H5N6亞型禽流感病毒滅活效果的研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2018，48（9）：1139-1145.

[6] 薄玉霞，SYED A S .評價(jià)化學(xué)消毒劑對病毒滅活效果的中和劑選擇試驗(yàn)[J].中國消毒學(xué)雜志，2007，24（6）：523-524.

[7] 秦秀慧，張? 冰，李? 軍，等.戊二醛復(fù)合消毒劑對豬病病毒殺滅效果的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002，10（2）：117-119.