問(wèn)清江，慕 娟，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)能夠以蔗糖為碳源產(chǎn)生右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase,EC 2.4.5.1)，該酶是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferases)，可以蔗糖為底物，將蔗糖分子中的D-吡喃葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到葡聚糖分子中，可以生成不同分子量的右旋糖酐(α-葡聚糖)，同時(shí)生成果糖[1-3]。右旋糖酐是α-葡聚糖，是若干葡萄糖脫水形成的高分子聚合物，主要由α-1,6糖苷鍵連接而成[4]。右旋糖酐安全、無(wú)毒，且結(jié)構(gòu)疏松柔軟，具有較好的水溶性及持水性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、色譜分析、石油工業(yè)等領(lǐng)域[5]。在研究金屬離子對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226產(chǎn)右旋糖酐發(fā)酵影響中發(fā)現(xiàn)，Mn2+對(duì)發(fā)酵液中的果糖和右旋糖酐兩種代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果不同。因此研究Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226產(chǎn)右旋糖酐的影響，首先研究Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長(zhǎng)的作用，然后是Mn2+對(duì)發(fā)酵中果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶產(chǎn)生的影響，最后是Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶作用的影響。對(duì)作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索，為現(xiàn)行的右旋糖酐發(fā)酵生產(chǎn)及未來(lái)右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐提供參考，另外當(dāng)有類似于Mn2+等具有氧化還原性物質(zhì)存在時(shí)，利用氧化還原反應(yīng)檢測(cè)代謝產(chǎn)物就會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，在遇到具體問(wèn)題應(yīng)考慮影響的存在，并改進(jìn)方法消除影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Leuconstocmesenteriodes-1226 (Lm-1226)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 白砂糖120，蛋白胨 1.7，磷酸氫二鈉1.4，pH 7.0。

1.1.3 試劑與儀器 果糖(D-(-)-fructose),Sigma 公司產(chǎn)品；3,5-二硝基水楊酸(DNS),化學(xué)純；其他試劑為市售分析純；白砂糖(市售一級(jí))。722分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SPX-150BIII生華培養(yǎng)箱；GH-500型隔水式培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長(zhǎng)的影響 采用比濁法測(cè)定菌體生物量，以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入液體培養(yǎng)基中，不加氯化錳為對(duì)照，將腸膜狀明串珠菌Lm-1226接入，25 ℃靜止培養(yǎng)24 h，于600 nm下測(cè)OD值。

1.2.2 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖的影響 保持發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變，以1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，不加氯化錳為對(duì)照，將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃靜止培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的果糖。

1.2.3 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響 保持發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變，以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，不加氯化錳為對(duì)照，將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃靜止培養(yǎng)24 h。將75%乙醇按135 mL/100 mL發(fā)酵液加入到發(fā)酵液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，放置，收集沉淀，沉淀?5%乙醇洗滌3次，烘干為右旋糖酐。

1.2.4 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的影響 保持發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變，以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，不加氯化錳為對(duì)照，將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃靜止培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液右旋糖酐蔗糖酶活力。

1.2.5 Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶作用的影響 右旋糖酐發(fā)酵液進(jìn)行一定的稀釋，10 000 r/min離心15 min，收集上清液為右旋糖酐蔗糖酶酶液，在適當(dāng)稀釋的酶液中加入2.5、5.0、7.0、10.0、12.5、15.0 mmol/L不同濃度的Mn2+，以蔗糖為底物，右旋糖酐蔗糖酶在Mn2+濃度為1.25、2.5、3.5、5.0、6.25、7.5 mmol/L不同反應(yīng)體系中作用，測(cè)定酶活力，以確定Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶作用的影響。

1.2.6 果糖和右旋糖酐蔗糖酶活力測(cè)定[6]采用DNS法測(cè)定右旋糖酐蔗糖酶活力。配制1 mg/mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補(bǔ)齊1.0 mL，再加入2.0 mL DNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測(cè)定光吸收值，繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程用于果糖和酶活的測(cè)定。將發(fā)酵液用蒸餾水適當(dāng)稀釋為待測(cè)樣品，取1.0 mL樣品，加入2.0 mL DNS溶液，沸水浴2 min顯色，其余同果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)酵液相對(duì)應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基同樣品測(cè)定作為空白對(duì)照(Mn2+與DNS發(fā)生反應(yīng))，以蒸餾水為對(duì)照測(cè)定540 nm的吸光值，樣品和空白對(duì)照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出發(fā)酵液中的果糖量。將酶液用pH 5.4的0.2 mol/L醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，取0.5 mL的稀釋酶液加入0.5 mL 10%的蔗糖溶液中，25 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)1 h，加入2 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對(duì)照的酶液和DNS加入順序顛倒，其余同樣品測(cè)定。以蒸餾水為對(duì)照測(cè)定540 nm的吸光值，樣品和空白對(duì)照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應(yīng)液中的果糖量，從而確定酶活。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘催化蔗糖產(chǎn)生1 μmol果糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(IU)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長(zhǎng)的影響

以不同Mn2+濃度將氯化錳加入培養(yǎng)基中，腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著Mn2+濃度的增加，發(fā)酵液中Lm-1226菌密度先增長(zhǎng)，當(dāng)Mn2+濃度為0.6 mmol/L時(shí)，菌密度最大，且大于對(duì)照，隨后菌密度急劇下降。結(jié)果表明，一定濃度的Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

圖1 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of Mn2+ on Lm-1226 growing

2.2 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵的影響

2.2.1 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中按不同Mn2+濃度加入氯化錳，對(duì)發(fā)酵液中的果糖進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。含有Mn2+的發(fā)酵液中果糖量均低于對(duì)照組，且隨著Mn2+濃度的增加，發(fā)酵液中的果糖含量逐漸降低，說(shuō)明Mn2+抑制腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖，且Mn2+濃度越高，抑制性越強(qiáng)。

圖2 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖的影響Fig.2 The effect of Mn2+ on fructose production of Lm-1226

2.2.2 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響 在不同濃度Mn2+發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌Lm-1226，對(duì)發(fā)酵液中的右旋糖酐進(jìn)行乙醇沉淀分離提取，從圖3可以看出，加入Mn2+的發(fā)酵液與對(duì)照組相比，右旋糖酐的產(chǎn)量急劇下降，且隨著Mn2+濃度的增加，繼續(xù)逐漸降低。Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖3 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響Fig.3 The effect of Mn2+ on dextran production of Lm-1226

2.2.3 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的影響 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的作用結(jié)果表明(圖4)，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Mn2+的右旋糖酐蔗糖酶活力均低于對(duì)照組，但是不同Mn2+濃度對(duì)產(chǎn)酶水平的影響有所不同，0.2～0.6 mmol/L右旋糖酐蔗糖酶活力先增高，0.4 mmol/L時(shí)相對(duì)最高；其后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，0.6～1.0 mmol/L酶活力基本不變；隨后又下降，3.0～7.0 mmol/L酶活力基本不變；之后酶活力大幅度下降?？傊?，與對(duì)照相比較Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用。

圖4 Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的影響Fig.4 The effect of Mn2+on dextransucrase production of Lm-1226

2.3 Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶作用的影響

腸膜狀明串珠菌Lm-1226產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶在不同Mn2+濃度的反應(yīng)體系中作用結(jié)果見(jiàn)圖5，在1.25～7.5 mmol/L Mn2+濃度范圍內(nèi)，右旋糖酐蔗糖酶作用開(kāi)始隨著Mn2+濃度的增加而增強(qiáng)，5.0 mmol/L時(shí)作用最強(qiáng)，為對(duì)照的158%；隨后增強(qiáng)作用逐漸降低，但是酶的作用均高于對(duì)照。Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶具有較強(qiáng)的激活作用，最適Mn2+濃度為5.0 mmol/L。

圖5 Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶作用的影響Fig.5 he effect of Mn2+ on dextransucrase

3 討 論

腸膜狀明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐在我國(guó)具有幾十年的歷史，但是相關(guān)企業(yè)主要采用半無(wú)菌發(fā)酵工藝，其缺點(diǎn)是產(chǎn)率低、產(chǎn)品質(zhì)量差，后續(xù)藥用右旋糖酐產(chǎn)品的用藥安全存在隱患。為了解決這一問(wèn)題，對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，在金屬離子對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，果糖隨著Mn2+濃度的增加一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而右旋糖酐則是下降趨勢(shì)；在發(fā)酵液右旋糖酐蔗糖酶活力測(cè)定時(shí)，空白對(duì)照的光吸收值隨著Mn2+濃度的增加而增加。這是由于Mn2+具有氧化還原性，對(duì)DNS測(cè)定果糖因Mn2+自身與DNS發(fā)生反應(yīng)而影響到檢測(cè)結(jié)果，為此將DNS測(cè)定果糖方法進(jìn)行改進(jìn)，消除Mn2+自身的影響。因此在應(yīng)用DNS測(cè)定還原糖時(shí)，要考慮到樣品中是否含有具有還原性的其他物質(zhì)，若有類似Mn2+的還原性物質(zhì)，則需要改進(jìn)檢測(cè)方法，消除其對(duì)還原糖檢測(cè)結(jié)果的影響。對(duì)Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶，右旋糖酐蔗糖酶作用影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，一定濃度的Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用；Mn2+抑制腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖和右旋糖酐，且Mn2+濃度越高，抑制性越強(qiáng)； Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用,該抑制作用與Mn2+濃度增大所呈現(xiàn)變化趨勢(shì)與果糖和右旋糖酐產(chǎn)生的不同，不是一直隨Mn2+的增大而增強(qiáng)，而是有波動(dòng)，可能與Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶的作用有促進(jìn)作用相關(guān)；Mn2+對(duì)右旋糖酐蔗糖酶具有較強(qiáng)的激活作用，激活作用可達(dá)158%，最適Mn2+濃度為5.0 mmol/L。根據(jù)這一研究結(jié)果，在腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐過(guò)程中，種子培養(yǎng)基中加入Mn2+有助于Lm-1226的生長(zhǎng)；應(yīng)用右旋糖酐蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖合成右旋糖酐中加入Mn2+，可以促進(jìn)右旋糖酐蔗糖酶的作用，提高蔗糖的轉(zhuǎn)化率和右旋糖酐的產(chǎn)率。Mn2+對(duì)腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵的影響僅僅進(jìn)行了初步研究，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究和探索。