胡榮濤，暢 英，陸嬌嬌，施碧紅

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是曲霉屬中的重要成員之一，在微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是食品發(fā)酵行業(yè)，醬油、清酒等的生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)用廣泛。米曲霉為產(chǎn)孢子絲狀真菌，其分生孢子由有隔菌絲頂端或分生孢子梗特化而成，是米曲霉的主要繁殖細(xì)胞。米曲霉分生孢子多為圓球狀，少數(shù)為扁球型，孢子內(nèi)部的核數(shù)目具有多樣性，多數(shù)為多核(核數(shù)目≥2)，少數(shù)為單核[1]，且在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生核型的變化。孢子核數(shù)目的不同會(huì)影響孢子大小、萌發(fā)率及對(duì)外界環(huán)境的敏感性等[1-3]。生產(chǎn)實(shí)踐中不同核型孢子遺傳穩(wěn)定性差異會(huì)影響菌種的選育工作。分析生長(zhǎng)過(guò)程孢子中蛋白組成的變化，有助于探討米曲霉發(fā)育過(guò)程核型變化的遺傳機(jī)制。雙向電泳是研究不同細(xì)胞類(lèi)型中蛋白表達(dá)差異的有效手段[4]。利用雙向電泳研究米曲霉不同核型孢子中蛋白的差異，首先需建立提取制備孢子蛋白的高效穩(wěn)定方法。真菌細(xì)胞壁的主要成分是多糖，另有少量蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。米曲霉細(xì)胞壁多糖主要為葡聚糖、幾丁質(zhì)[5]，孢子細(xì)胞壁較厚且結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌，不易破碎，破碎不易完全，孢內(nèi)蛋白提取較為困難[6]。為此我們對(duì)米曲霉孢子的破壁方法進(jìn)行系列試驗(yàn)。本研究擬通過(guò)5種不同的破壁方法對(duì)米曲霉孢子進(jìn)行破壁處理，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算破壁率，并進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，最終使用雙向凝膠電泳驗(yàn)證破壁方法的可行性。從而明確不同機(jī)械破壁方法的破壁效果，選出破壁效率高、簡(jiǎn)便易行、且適用于雙向電泳蛋白質(zhì)分析的破壁方法，為進(jìn)一步研究米曲霉孢子蛋白質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 米曲霉FS1125為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)及孢子懸液制備 CD培養(yǎng)基：NaNO30.3,KH2PO40.1,MgSO4·7H2O 0.05,KCl 0.2,FeSO4·7H2O 0.002,葡萄糖 2,瓊脂糖 2。30 ℃培養(yǎng)9 d，收集孢子懸液，離心、裂解液(8 mol/L尿素，4% CHAPS，2% IPG buffer，40 mmol/L DTT)重懸以獲得不同濃度的孢子懸液，并用雙層擦鏡紙濾去菌絲,血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)[7]。

1.1.3 試劑及儀器 LHR-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器)，TGL-16M高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀)，超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)，均質(zhì)器(MP·Fast-prep)，普通光學(xué)顯微鏡(重慶光電)，SDS-PAGE小型垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)，Ettan IPG phor 3雙向電泳系統(tǒng)(GE Healthcare)，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(生工生物工程)，蛋白染色液G-250(生工生物工程)，尿素、CHAPS、DTT、IAA、IPG buffer、IPG膠條、礦物油均購(gòu)自GE公司，其他試劑購(gòu)自西隴化工。

1.2 方法

1.2.1 破壁方法 ①石英砂研磨：按50 mg/mL加入石英砂，直接研磨；②超聲破碎：孢子懸液在冰水浴中進(jìn)行超聲破壁(工作30 s，間歇45 s破壁20 min)；③石英砂+超聲破碎：按50 mg/mL加入石英砂，研磨3～5 min成糊狀，再超聲處理；④液氮研磨：將一定量的已測(cè)定濃度的孢子懸液離心，棄上清，置于研砵中，液氮多次研磨直至絮狀，再加入與原先等量的裂解液復(fù)溶；⑤MP·Fast-prep均質(zhì)器法：采用均質(zhì)器進(jìn)行破壁處理(振蕩速度5.0 m/s，工作時(shí)間30 s)，間隔冰水浴反復(fù)進(jìn)行10次循環(huán)。

1.2.2 破壁觀察與破壁率測(cè)定 采用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行破壁觀察并拍照，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定破壁前后完整的孢子數(shù)目，計(jì)算破壁率[8-9]。破壁率為3個(gè)重復(fù)樣的平均值。

1.2.3 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取7支試管，分別加入0、10、20、40、60、80、100 μL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)，并用裂解液補(bǔ)足100 μL。再分別加入3 mL的蛋白染色液G-250。所有溶液加入5 min，待溶液顏色穩(wěn)定，用分光光度計(jì)測(cè)定每管溶液在595 nm下的吸光值(比色空白皿用3 mL的蛋白染色液G-250)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品蛋白濃度測(cè)定 破壁處理后的孢子懸液經(jīng)過(guò)7 000 r/min離心10 min，去除孢子碎片后，取100 μL上清液于試管中，加入3 mL蛋白染色液G-250，反應(yīng)5 min待顏色穩(wěn)定后，于595 nm下比色(比色空白皿用3 mL蛋白染色液G-250)測(cè)定其吸光值，并計(jì)算蛋白質(zhì)含量[10]。

1.2.5 孢子可溶性蛋白SDS-PAGE 將孢子經(jīng)過(guò)以上5種不同破壁方法處理，離心取得的上清液，進(jìn)行SDS-PAGE。采用不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳，5% 濃縮膠(pH 6.8)和12% 分離膠(pH 8.8)。電壓90 V，電流400 mA,時(shí)間90 min。電泳停止后用R250染色液進(jìn)行染色。

1.2.6 雙向電泳可行性驗(yàn)證 篩選出具有最高破壁率的方法所得到的樣品液進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)，驗(yàn)證該破壁方法是否能適用于雙向電泳樣品制備[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微觀察結(jié)果

在普通光學(xué)顯微鏡下觀察米曲霉孢子破壁前后形態(tài)，可見(jiàn)孢子破壁前為圓球狀孢子，破壁后多為細(xì)胞碎片，少數(shù)為孢壁內(nèi)空?qǐng)A球(圖1)。

圖1 米曲霉孢子破壁前后的顯微觀察Fig.1 The Aspergillus oryzae conidia before and after rupture under optical MicroscopeA：孢子破壁前形態(tài)；B：孢子破壁后形態(tài)(空心箭頭指向?yàn)榧?xì)胞碎片，黑色箭頭指向?yàn)殒弑趦?nèi)空?qǐng)A球)A: conidia before rupture；B: conidia after rupture(The hollow arrow points to the broken fragments of conidia,the black arrow points to the empty sphere)

對(duì)不同濃度的米曲霉孢子采用1.2.1所示的破壁方法，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，結(jié)果表明：在孢子濃度較低(約107個(gè)/mL)時(shí)，方法③、④、⑤都具有較高的破壁率(>70%,表1)，且方法⑤>③>④，其中方法⑤破壁率高達(dá)97%。隨著孢子濃度的增加(約109個(gè)/mL)，方法①和②的破壁率太低，不具有統(tǒng)計(jì)意義，不進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；方法③和④都出現(xiàn)了不同程度的破壁不完全，而方法⑤仍具有最優(yōu)且穩(wěn)定的高破壁率(90%，表1)。對(duì)表1中的2種不同濃度的孢子采用方法⑤的破壁效果均顯著高于其他4種破壁方法(t檢驗(yàn))。

表1 不同濃度的米曲霉孢子的破壁率Table 1 Wall-broken rates of different concentration conidia of Aspergillus oryzae

注：“-”表示破壁率太低，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義；A、B表示P<0.001的顯著差異，下表同

2.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

為測(cè)定破壁后孢子釋放的蛋白含量，先用牛血清蛋白標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2，R2=0.999 1，線性良好。后續(xù)待測(cè)樣品經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)后，可利用該曲線線性關(guān)系計(jì)算蛋白含量。

圖2 牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of bovine serum proteins

2.3 可溶性蛋白含量

用Bradford方法測(cè)定米曲霉孢子在不同破壁方法處理下釋放出的可溶性蛋白含量見(jiàn)表2。結(jié)果表明：經(jīng)方法③、④、⑤處理的孢子均有不同的蛋白量釋出并且與破壁率的結(jié)果一致(方法⑤>③>④),且不論孢子濃度為107或109個(gè)/mL，經(jīng)方法⑤破壁后釋放的可溶性蛋白含量均顯著高于方法③或④(t檢驗(yàn))。另外從表2也可看出對(duì)于同一破壁方法，高濃度孢子懸液(109個(gè)/mL)破壁后其可溶性蛋白含量要顯著高于低濃度孢子懸液(107個(gè)/mL)。為滿(mǎn)足后續(xù)雙向電泳對(duì)樣品蛋白濃度的要求，需采用高濃度孢子懸液(109個(gè)/mL)進(jìn)行破壁及蛋白提取。故方法⑤是首選破壁方法，因?yàn)殡S著米曲霉孢子濃度的不斷加大，只有方法⑤可以保持高破壁率，并保障孢子內(nèi)部蛋白質(zhì)的釋出。

表2 米曲霉孢子破壁后釋出的可溶性蛋白含量Table 2 The soluble Protein releasing from broken spores

2.4 孢子可溶性蛋白SDS-PAGE

將濃度約為109個(gè)/mL的孢子分別經(jīng)3種不同破壁方法處理的蛋白提取樣品進(jìn)行SDS-PAGE(圖3)，結(jié)果表明：3種方法處理的樣品均可見(jiàn)清晰蛋白條帶，方法⑤獲得的樣品條帶最清晰明顯，顏色也更深。比較三者的蛋白條帶顯色清晰排序?yàn)榉椒á?③>④，與分光光度計(jì)檢測(cè)的蛋白含量排序相吻合。

圖3 米曲霉孢子可溶性蛋白的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of soluble protein in Aspergillus oryzae conidiaA、B為方法③破壁樣品；C、D為方法④破壁樣品；E、F為方法⑤破壁樣品A and B were broken by Quartz sand grinding plus ultrasonic treatment method；C and D were from Liquid nitrogen grinding method；E and F were by MP·Fast-prep method

2.5 可溶性蛋白雙向電泳

將方法⑤破壁提取可溶性蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳驗(yàn)證，結(jié)果表明使用該方法進(jìn)行米曲霉孢子的破壁，并進(jìn)行孢內(nèi)蛋白的提取,其樣本是適用于雙向電泳試驗(yàn)的(圖4)。

圖4 米曲霉孢子破壁釋出可溶性蛋白雙向電泳圖譜 Fig.4 Two-dimensional electrophoresis of the conidia protein in Aspergillus oryzae

由圖4可見(jiàn)較為清晰豐富的蛋白點(diǎn)，且不存在橫、縱向拖尾問(wèn)題。說(shuō)明使用方法⑤對(duì)米曲霉孢子進(jìn)行破壁提取蛋白適用于雙向電泳的樣品制備。

3 討 論

雖然目前已有不少文獻(xiàn)報(bào)道真菌菌體蛋白提取方法,如單振秀等采用3種破壁方法對(duì)抗 Cr6+真菌進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)使用超聲波法破壁效果最好[12];萬(wàn)其兵等[13]用4種破壁方法處理DS-9701菌株，結(jié)果表明石英砂+超聲的方法效果較佳；王燕等用酶法進(jìn)行米曲霉破壁[14]，但酶解法會(huì)導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化和蛋白位點(diǎn)的移動(dòng)[15]，可能會(huì)對(duì)進(jìn)一步的孢內(nèi)蛋白分析造成影響；劉東奇等[16]用6種方法對(duì)啤酒酵母進(jìn)行破壁實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明微波法具有最佳破壁效果，破壁率達(dá)到49%。但是關(guān)于米曲霉分生孢子的破壁及其蛋白提取方法還鮮見(jiàn)報(bào)道。

蛋白質(zhì)提取的關(guān)鍵步驟是細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)溶解。本研究采用5種不同的破壁方法對(duì)米曲霉孢子進(jìn)行破壁，結(jié)果表明：方法①石英砂研磨和方法②超聲的破壁率不高，不適用于米曲霉孢子破壁；方法③石英砂+超聲、④液氮研磨、⑤MP·Fast-prep均質(zhì)器有較高的破壁率，但隨著孢子濃度的提升，方法③石英砂+超聲、方法④液氮研磨的破壁效果有所下降。如果通過(guò)延長(zhǎng)處理時(shí)間等方法進(jìn)行補(bǔ)救，有可能導(dǎo)致孢子內(nèi)含物變性等問(wèn)題。綜合考慮，方法⑤MP·Fast-prep均質(zhì)器破壁法為米曲霉孢子的最佳破壁方法。該法不論是破壁率還是孢內(nèi)蛋白釋放量都較高且穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便、液量損失少、破壁方法對(duì)孢子內(nèi)蛋白質(zhì)無(wú)明顯影響，樣品可用于SDS-PAGE和雙向電泳，該方法的建立為米曲霉蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究提供了參考。