畢文慧，姚 健，陳慶隆，馬吉平，王洪秀

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)又稱(chēng)羧酸酯酶，是一種多聚蛋白，可催化酯類(lèi)中羧酸酯鍵的裂解，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)[1-6]。酯酶可與多種底物特異性結(jié)合，反應(yīng)具有可逆性，可催化底物的水解反應(yīng)及合成反應(yīng)，具有較高的區(qū)域選擇性或?qū)τ尺x擇性[7-8]，其作為一種重要的工業(yè)酶類(lèi)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[9-10]。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酯酶是工業(yè)化酯酶生產(chǎn)的重要途徑，自然界中產(chǎn)酯酶微生物種類(lèi)繁多、分布廣泛，從不同生境中篩選各類(lèi)產(chǎn)酯酶菌株可擴(kuò)展酯酶種類(lèi)，擴(kuò)大應(yīng)用范圍[6，8]。國(guó)內(nèi)外研究人員已從真菌(黑曲霉、黃曲霉、紅曲霉、根酶、青霉及酵母等)、細(xì)菌[1，7-12](芽胞桿菌屬、假單胞桿菌屬等)及放線(xiàn)菌[13-15]中篩選得到多種產(chǎn)中溫酯酶微生物。但中溫酯酶在使用中存在局限性，在一些高溫化學(xué)反應(yīng)中無(wú)法應(yīng)用，且催化效率、底物專(zhuān)一性、生物穩(wěn)定性均無(wú)法與嗜熱酯酶相比。本研究從某沼氣站堆肥發(fā)酵周邊的土壤中篩選到了1株嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生的酯酶為嗜熱酯酶，其最適反應(yīng)溫度為75 ℃。在75 ℃條件下處理12 h，其酶活性沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明該酶具有極高的溫度穩(wěn)定性，70%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亞砜、乙醇、異丙醇和丙酮等有機(jī)溶劑對(duì)酯酶活性均有激活作用，該酯酶的溫度穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑耐受性可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，并為進(jìn)一步克隆嗜熱酯酶基因提供了微生物菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 用于產(chǎn)酯酶菌株的分離樣品來(lái)源于某沼氣站堆肥發(fā)酵周邊的土壤(夏季采集樣品)。

1.1.2 所用試劑 對(duì)硝基苯酚乙酸酯(pNPC2)、對(duì)硝基苯酚丁酸酯(pNPC4)、對(duì)硝基苯酚己酸酯(pNPC6)、對(duì)硝基苯酚辛酸酯(pNPC8)和對(duì)硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)，對(duì)硝基苯酚月桂酸酯(pNPC12)和對(duì)硝基苯酚均購(gòu)自sigma公司，Taq酶和連接酶購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基(g/L) 篩選培養(yǎng)基[10]：牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,三丁酸甘油酯 5,瓊脂 20,pH自然,121 ℃滅菌15 min。液體培養(yǎng)基：牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 10,pH自然，121 ℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 酯酶產(chǎn)生菌的分離 用無(wú)菌水對(duì)土壤樣品進(jìn)行梯度稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取具透明圈的菌落，再次接種到篩選培養(yǎng)基上，反復(fù)多次劃線(xiàn)純化直到獲得純培養(yǎng)物。分別測(cè)量單菌落水解圈直徑與菌落直徑，兩者比值(HC值)越大表示其水解三丁酸甘油酯能力越強(qiáng)，篩選5株HC值最大的菌株。

1.2.2 酯酶高產(chǎn)菌株的篩選 將初篩篩選到的菌株接種到10 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液中的酶活力。

1.2.3 菌株鑒定 ①形態(tài)觀(guān)察：將篩選到的菌株活化后接種于篩選平板上，37 ℃下培養(yǎng)2 d，觀(guān)察菌落形態(tài)。 ②菌株的生理生化鑒定：參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。菌株對(duì)葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖的利用：在液體培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，每隔4 h分別取樣檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖的利用情況。H2O2酶、纖維素酶及淀粉酶活性檢測(cè)：取經(jīng)液體培養(yǎng)的發(fā)酵液，分別以H2O2、羧甲基纖維素及可溶性淀粉為底物，檢測(cè)H2O2酶，纖維素酶及淀粉酶活性。③16S rDNA序列分析：參照姚健等[17]的方法。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，以基因組DNA為模板，27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(3′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-5′)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌，培養(yǎng)后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast軟件序列比對(duì)，用MEGA5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 酶活測(cè)定 ①對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：用蒸餾水將5 mmol/L硝基苯酚(溶解于乙醇中)稀釋成不同濃度(0.3、0.6、 0.9、 1.2和1.5 mmol/L)；向各離心管中分別加入90 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和10 μL上述不同濃度的對(duì)硝基苯酚，75 ℃保溫10 min，然后加入50 μL 2 mol/L 的Na2CO3，冰上放置20 min，5 000 g離心5 min后，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，用蒸餾水代替對(duì)硝基苯酚作為空白進(jìn)行調(diào)零。以吸光值為縱坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。②酯酶活力的測(cè)定：將篩選到的菌株接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，12 000 g離心5 min后取上清液作為粗酶液。參照文獻(xiàn)[17]的方法稍作修改測(cè)定酯酶活力。取10 μL粗酶液，加入80 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和10 μL 20 mmol/L硝基苯酚丁酸酯(溶解于乙醇中)，75 ℃保溫10 min，加入50 μL 2 mol/L 的Na2CO3終止反應(yīng)，冰上放置20 min，5 000 g離心5 min，取上清，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

空白對(duì)照：取80 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和10 μL 20 mmol/L硝基苯酚丁酸酯(溶解于乙醇中)，加入50 μL 2 mol/L 的Na2CO3和10 μL 100 ℃處理30 min的酶液，75 ℃保溫10 min，冰上放置20 min，5 000 g離心5 min，取上清，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度；1個(gè)酶活力單位定義為1 min釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。蛋白濃度利用Bradford方法檢測(cè)。

經(jīng)測(cè)定，對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)解析式為A405=0.146 6C，R2=0.998，C為對(duì)硝基苯酚的濃度(mmol/L)，根據(jù)此解析式可計(jì)算產(chǎn)物生成量，由酶活定義換算成酶活力公式：

酶活力(U/mg)=

式中：0.342 mg/mL為粗酶液中蛋白質(zhì)量濃度。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究 ①酶的底物特異性:取10 μL粗酶液，加入10 μL 20 mmol/L不同碳鏈長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酚酯類(lèi)物質(zhì)，按照1.2.4方法測(cè)定酶活性，以確定酶的最適反應(yīng)底物。②酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性：按1.2.4方法，以35 ℃為起始溫度，每升高5 ℃測(cè)定1次粗酶液的酯酶活性，直到90 ℃為止；另外，將粗酶液分別在上述不同溫度條件下放置12 h，然后檢測(cè)粗酶液在最適反應(yīng)條件(最適pH、最適溫度)下的溫度穩(wěn)定性，以4 ℃放置的粗酶液的酶活性定義為100%。③酶的最適反應(yīng)pH：取10 μL粗酶液，將反應(yīng)體系的pH分別用100 mmol/L醋酸鹽緩沖液調(diào)整至pH 4.0～6.0、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液調(diào)整至pH 5.5～8.0、100 mmol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)整至pH 7.5～9.0，然后在最適反應(yīng)溫度下按1.2.4方法測(cè)定粗酶液的酯酶活性。④金屬離子及有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響：取90 μL粗酶液，分別加入10 μL 0.2 mol/L的金屬離子(Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+和Na+)，室溫放置30 min后在最適反應(yīng)條件下測(cè)剩余酶活性。取100 μL粗酶液，分別加入有機(jī)溶劑(甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亞砜、乙醇、異丙醇和丙酮)，使其終濃度為70%，室溫放置30 min后在最適反應(yīng)條件下測(cè)剩余酶活性，以未加金屬離子及有機(jī)溶劑的酶活定義為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

利用三丁酸甘油酯選擇培養(yǎng)基從土壤樣品中分離篩選到了10株能產(chǎn)生透明圈的菌株，根據(jù)HC值的大小，選擇5株進(jìn)行液體培養(yǎng)復(fù)篩。其中1株菌株產(chǎn)生的酯酶具有較高的溫度穩(wěn)定性，因此選定其做進(jìn)一步的鑒定，并將其命名為YJ 1-1。

2.2 菌株YJ 1-1的鑒定

菌株YJ 1-1在固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落呈灰黃色，表面濕潤(rùn)且較黏稠，邊緣整齊。顯微鏡下個(gè)體形態(tài)為桿狀，經(jīng)革蘭染色發(fā)現(xiàn)該菌株為陰性菌，嚴(yán)格需氧，H2O2酶陽(yáng)性，纖維素酶及淀粉酶均為陰性。另外，該菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠利用葡萄糖、乳糖和木糖，但不能利用蔗糖。

16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)片段序列長(zhǎng)為1 420 bp，將序列提交至GenBank，登錄號(hào)為 KX863515，對(duì)菌株YJ 1-1的16S rDNA序列分析表明，該菌株與多株嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)16S rDNA 的相似性為99%，結(jié)合其形態(tài)及生理生化特征，將菌株YJ 1-1初步鑒定為嗜麥寡養(yǎng)單胞菌，命名為StenotrophomonasmaltophiliaYJ 1-1。其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

2.3 酯酶酶學(xué)特性分析

2.3.1 酯酶的底物特異性 用100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)分別配置6種底物溶液(pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8、pNPC10和pNPC12)，然后加入酶液，在50 ℃條件下測(cè)定酶活力(在75 ℃和pH 7.0條件下，酯酶對(duì)對(duì)硝基苯酚丁酸酯(C4)的最高酶活為100%)，結(jié)果如圖2 所示，pNPC4作為底物時(shí)的相對(duì)酶活力最大，pNPC2作為底物時(shí)的相對(duì)酶活力次之，pNPC8、pNPC10和pNPC12作為底物時(shí)的相對(duì)酶活力很低，表明菌株StenotrophomonasmaltophiliaYJ 1-1產(chǎn)生的胞外蛋白均為酯酶，而非脂肪酶。

圖1 菌株16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic tree of strain based on 16S rDNA sequence homology

圖2 嗜熱酯酶對(duì)不同底物反應(yīng)特異性析Fig.2 Analysis of different substrates hydrolyzed by the thermophilic esterase

2.3.2 pH及溫度對(duì)酶活性的影響 以對(duì)硝基苯酚丁酸酯為底物測(cè)酯酶活性(以對(duì)硝基苯酚丁酸酯為底物，在75 ℃、pH 7.0下測(cè)得的酶活作為100%)，如圖3所示，隨著pH的升高，酯酶活性逐步升高，在pH 7.0時(shí)，StenotrophomonasmaltophiliaYJ 1-1酯酶活性達(dá)到最高值，之后活性逐漸下降，故其最適反應(yīng)pH為7.0；在溫度低于45 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酯酶的酶活性迅速提高；其后隨著溫度的升高，酯酶活性緩慢升高，當(dāng)溫度升高到75 ℃時(shí)，酶活性達(dá)到最高值；其后隨著溫度的升高，酯酶活性迅速降低，當(dāng)溫度升高到85 ℃時(shí)，酯酶的酶活性?xún)H為最高值的10%左右，故StenotrophomonasmaltophiliaYJ1-1酯酶的最適反應(yīng)溫度為75 ℃ (圖4)。此外，該酶在50～75 ℃條件下，均能保持很好的穩(wěn)定性，說(shuō)明該酶在75 ℃時(shí)酶活力高而且穩(wěn)定，是一個(gè)極其穩(wěn)定的嗜熱酶(圖5)。

圖3 pH對(duì)嗜熱酯酶活性影響Fig.3 Effects of pH on activity of thermophilic esterase

圖4 溫度對(duì)嗜熱酯酶活性的影響Fig.4 Effects of temperature on activity of thermophilic esterase

2.3.3 金屬離子及有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響 如表1所示，Mg2+及Na+對(duì)酯酶有激活作用，Cu2+、Zn2+和Fe3+對(duì)酯酶活性有抑制作用。體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亞砜、乙醇、異丙醇和丙酮等有機(jī)溶劑對(duì)酯酶活性均有激活作用，分別使酯酶活性提高了2.30、4.65、2.05、1.30、5.02、1.74、1.09和2.12倍。

圖5 溫度對(duì)嗜熱酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of temperature on stability of thermophilic esterase

表1 金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)酯酶活性的影響Table 1 Effects of chemicals on activity of esterase

3 討 論

與化學(xué)催化劑及中低溫酯酶相比，嗜熱酯酶可以在高溫條件下保持很好的穩(wěn)定性，使很多高溫化學(xué)反應(yīng)得以穩(wěn)定進(jìn)行；同時(shí)在生產(chǎn)過(guò)程中，嗜熱酯酶催化的化學(xué)反應(yīng)對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低，這一方面減少了能耗，另一方面也降低了冷卻過(guò)程造成的環(huán)境污染。近年來(lái)，人們已從嗜熱微生物中分離得到多種嗜熱酯酶，如Asoodeh等[19]從熱泉中篩選到了1株產(chǎn)嗜熱酯酶的海洋斯瓦尼氏菌88，其生產(chǎn)的酯酶的最適反應(yīng)溫度為58 ℃。解秋桂等[20]研究了古細(xì)菌AeropyrumpernixK1所產(chǎn)酯酶的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其90 ℃的半衰期為12 h。Zhang等[4]研究了來(lái)源于Sulfobacillusacidophilus的酯酶特性，研究表明該酯酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃，在該溫度下處理10 min，剩余酶活性?xún)H為原來(lái)的30%。來(lái)源于A(yíng)ctinomadurasp.的酯酶在80 ℃條件下處理60 min，已完全喪失其酶活性[21]。Gao等[22]利用宏基因組學(xué)從海底淤泥中篩選到酯酶，對(duì)丙酮及異丙醇都有一定的耐受性，但對(duì)甲醇及乙醇的耐受性較差，經(jīng)50%的甲醇及乙醇處理后，其剩余酶活性?xún)H為23.2%和0.5%。本研究從某沼氣站堆肥發(fā)酵周邊土壤樣品中分離篩選到了1株嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，該菌生產(chǎn)的酯酶是一種嗜熱酯酶，其最適反應(yīng)溫度為75 ℃，最適反應(yīng)pH為7.0，且該酶表現(xiàn)出極強(qiáng)的溫度穩(wěn)定性，在75 ℃處理12 h，其酶活性沒(méi)有明顯變化。70%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亞砜、乙醇、異丙醇和丙酮等有機(jī)溶劑對(duì)酯酶活性均有激活作用，分別使酯酶活性提高了2.30、4.65、2.05、1.30、5.02、1.74、1.09和2.12倍，并且該酯酶具有較高酶活性(0.981 U/mL或2.87 U/mg)，明顯高于摩氏摩根菌 ZJB-09203 酯酶的活性(0.18U/mg)[23]。另外，陳靜等[24]從肉牛瘤胃液中分離到1株產(chǎn)酯酶的大腸埃希菌RB1，酶活性檢測(cè)顯示在以對(duì)硝基苯酚乙酯為底物時(shí)，其酯酶的最高酶活性為0.52 U/mL，上述特征表明該酯酶可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。