何崇信 肖靜波 宛新建

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院上海市胰腺疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市第一人民醫(yī)院消化科(201620)

膽囊結(jié)石是消化系統(tǒng)疾病診療中最常見的病種之一，其發(fā)病率在西方發(fā)達(dá)國(guó)家約為10%～15%，我國(guó)為4.4%～8.2%[1]，80%～90%的膽囊結(jié)石屬于膽固醇結(jié)石。膽囊結(jié)石可引起膽絞痛、急性膽囊炎、膽汁性腹膜炎、繼發(fā)性膽總管結(jié)石、急性胰腺炎甚至膽囊癌等合并癥[2]，因此臨床上需予積極治療。

隨著對(duì)膽囊生理功能以及功能型膽囊切除對(duì)人體不利影響認(rèn)識(shí)的不斷深入，研究者對(duì)膽囊結(jié)石的治療是行膽囊切除術(shù)還是保膽取石術(shù)產(chǎn)生了爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，保留膽囊手術(shù)后所謂的結(jié)石易 “復(fù)發(fā)”是由于“術(shù)中殘留”而非“術(shù)后復(fù)發(fā)”[3]，如能保證取盡結(jié)石，同時(shí)改善脂質(zhì)代謝，則可顯著減少治療后復(fù)發(fā)。灌注藥物溶石是指將溶石藥物通過特定途徑灌注入膽囊，通過直接接觸結(jié)石發(fā)揮溶石作用，該技術(shù)也是保留膽囊的碎石術(shù)尤其是微創(chuàng)碎石術(shù)后迅速取盡殘留結(jié)石的有效方法[4]。目前最為經(jīng)典、有效的灌注溶石藥物為甲基叔丁基醚(methyl tertiary-butyl ether, MTBE)，但揮發(fā)性大、生物安全性欠佳限制了該藥的廣泛應(yīng)用。本文通過比較四種相對(duì)分子質(zhì)量依次增加的醚類藥物對(duì)膽囊結(jié)石的溶石效果及其生物安全性，以期為設(shè)計(jì)新型溶石藥物提供依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

人正常肝細(xì)胞株LO2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質(zhì)量140～160 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。MTBE、乙二醇單叔丁基醚(ethylene glycol mono-tert-butyl ether, ETB)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙基叔丁基醚(ethyl tertiary-butyl ether, ETBE)(上海麥克林生化科技有限公司)；二乙二醇單叔丁基醚[di(ethylene glycol) tert-butyl ether, DETB](上海安研商貿(mào)有限公司)；CCK-8細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(MedChemExpress.)；HE染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)。

二、方法

1. 體外溶石實(shí)驗(yàn)：收集上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科患者的膽囊結(jié)石(患者均簽署知情同意書)，使用紫外分光光度儀將結(jié)石分為混合性結(jié)石和膽固醇結(jié)石。實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)組別，分別為MTBE組、ETBE組、ETB組和DETB組。將兩類結(jié)石分別分為四組，置于試管中，各組結(jié)石質(zhì)量、體積相近，每試管5顆，分別加入上述藥物原液10 mL，置于37 ℃烘箱中。前12 h每3 h取出結(jié)石烘干后稱重，之后每9 h稱重一次，直至結(jié)石破碎或到達(dá)觀察終點(diǎn)72 h。藥物作用后直徑小于2 mm的結(jié)石不計(jì)入稱重范圍。實(shí)驗(yàn)期間不更換藥物。

2. CCK-8實(shí)驗(yàn)：LO2細(xì)胞以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3代后調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞密度達(dá)到80%。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換液，對(duì)照組予等量DMEM培養(yǎng)基、干預(yù)組分別予終濃度為200 mmol/L的相應(yīng)藥物處理12 h，更換為含10% CCK-8的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)，細(xì)胞活力=(干預(yù)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。每組藥物設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3. 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)：30只Sprague-Dawley大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和四組藥物干預(yù)組，每組6只。大鼠自由進(jìn)食，飲用無(wú)菌水。參考既往文獻(xiàn)[5]，按800 mg/kg的劑量分別予四種藥物灌胃(藥物溶于大豆油中)，每日1次，連續(xù)2周；對(duì)照組予等量大豆油灌胃。2周后，所有大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，常規(guī)解剖，取門靜脈血置于無(wú)致熱原試管中，室溫靜置30 min，4 ℃ 3 000 r/min 離心15 min，取血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)生化指標(biāo)。摘除肝、肺、腎、胃、十二指腸和空腸，各切取約1 cm×l cm×0.5 cm大小的組織塊，4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、四種醚類藥物溶石效果比較

體外溶石實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTBE溶石效果最為顯著(P<0.05)；ETBE對(duì)混合性結(jié)石的溶石效果與MTBE相當(dāng)，對(duì)膽固醇結(jié)石的溶石效果次于MTBE，但優(yōu)于ETB和DETB，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ETB和DETB的溶石效果雖有所下降，但仍較顯著(圖1)。

二、四種醚類藥物增殖毒性比較

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和MTBE組相比，ETBE組、ETB組、DETB組LO2細(xì)胞活力明顯降低，提示增殖毒性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組與MTBE組間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ETBE組細(xì)胞活力最低，增殖毒性最強(qiáng)，與ETB組、DETB組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ETB組與DETB組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

與同時(shí)間點(diǎn)ETB組、DETB組比較，*P<0.05，**P<0.01；#與同時(shí)間點(diǎn)ETBE組比較，#P<0.05，##P<0.01

兩組間比較，**P<0.01，***P<0.001

三、動(dòng)物模型血清生化指標(biāo)比較

血清生化指標(biāo)檢測(cè)顯示，各組間ALT、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (GGT)水平均低于對(duì)照組，除ETB組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DETB組與對(duì)照組間AST水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MTBE組、ETBE組、ETB組AST水平均明顯高于對(duì)照組和DETB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

四、動(dòng)物模型臟器組織病理學(xué)表現(xiàn)比較

各組動(dòng)物模型臟器HE染色觀察顯示，MTBE組空腸組織部分區(qū)域有淋巴濾泡形成、淋巴組織增生，各組胃腸道均未出現(xiàn)糜爛、明顯炎癥表現(xiàn)；MTBE組肺臟部分區(qū)域出現(xiàn)肺泡腔輕度擴(kuò)張、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其余各組肺臟組織病理學(xué)表現(xiàn)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異；其他各臟器各組間組織病理學(xué)表現(xiàn)與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異(圖3)。

討 論

膽石癥在我國(guó)膽道疾病中居首位，是膽道疾病治療的重點(diǎn)，其治療手段包括手術(shù)以及各種碎石、溶石方法。已知手術(shù)切除膽囊存在一定風(fēng)險(xiǎn)和一系列近、遠(yuǎn)期不良反應(yīng)，如十二指腸胃反流、原發(fā)性膽總管結(jié)石、急性膽道感染、結(jié)腸癌、胃癌等[6-9]。碎石、溶石方法主要有體外震波碎石、口服或直接接觸溶石，其中直接接觸溶石具有患者痛苦和損傷小、療效確切的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于不能耐受麻醉、手術(shù)或拒絕手術(shù)的患者。研究還證實(shí)，對(duì)于接受保留膽囊碎石術(shù)的患者，直接接觸溶石是取盡殘留結(jié)石的有效方法[4]。MTBE和ETBE的揮發(fā)性和特殊氣味限制了兩者的臨床應(yīng)用，因此尋找新型低揮發(fā)、 低毒性醚類溶石藥物具有重要臨床意義。

表1 四種醚類藥物對(duì)動(dòng)物模型血清生化指標(biāo)的影響

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與DETB組比較，P<0.05；△與MTBE組比較，P<0.05

圖3 四種醚類藥物對(duì)動(dòng)物模型臟器組織病理學(xué)表現(xiàn)的影響(HE染色，×200)

本研究采用體外溶石實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體正常體溫下的溶石效果，結(jié)果顯示隨著藥物相對(duì)分子質(zhì)量的增加，叔丁基醚類藥物的溶石效果逐漸降低。盡管ETB和DETB的作用較MTBE和ETBE有所下降，但仍有良好的溶石效果，在混合性結(jié)石和膽固醇結(jié)石溶石實(shí)驗(yàn)中均有體現(xiàn)。值得注意的是，ETB和DETB的密度接近1，因此兩者在膽囊內(nèi)的實(shí)際溶石效果與MTBE溶石效果的差異可能小于體外實(shí)驗(yàn)，因?yàn)镸TBE密度較低，灌注進(jìn)入膽囊后會(huì)漂浮于膽汁和結(jié)石之上，難以充分接觸結(jié)石發(fā)揮作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)MTBE盡管溶石效果極佳，但安全性差，可降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、引起線粒體和溶酶體損傷，并具有遺傳毒性[5，10-12]，此外還有諸如胃腸道反應(yīng)、黏膜刺激以及代謝產(chǎn)物甲醇的神經(jīng)毒性等諸多不良反應(yīng)。既往文獻(xiàn)報(bào)道ETBE對(duì)動(dòng)物局部組織和全身的毒性作用均較MTBE輕，且不會(huì)分解產(chǎn)生甲醇[13]。本研究采用人正常肝細(xì)胞株LO2研究四種醚類藥物的增殖毒性，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MTBE增殖毒性最低，ETBE增殖毒性最強(qiáng)，與既往研究[13]結(jié)果矛盾，可能與MTBE的強(qiáng)揮發(fā)性影響其毒性發(fā)揮有關(guān)。鑒于ETBE亦有一定揮發(fā)性，推測(cè)ETB和DETB的實(shí)際毒性與之相比可能更低，兩者增殖毒性降低可能與其相對(duì)分子質(zhì)量增加、細(xì)胞吸收減少有關(guān)[14]。藥物相對(duì)分子質(zhì)量增加可減少其在胃腸道的吸收，此點(diǎn)對(duì)于無(wú)需腸道吸收的灌注溶石藥物尤為重要，可提高其生物安全性。本研究動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示，僅MTBE可引起大鼠空腸和肺臟輕微炎癥反應(yīng)，其他醚類藥物對(duì)各臟器組織病理學(xué)均無(wú)明顯影響。血清生化指標(biāo)檢測(cè)顯示四種藥物對(duì)肝、腎功能亦無(wú)明顯影響。上述結(jié)果初步闡明了醚類藥物的一般安全性，但仍需通過更嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)，如設(shè)置藥物濃度梯度、延長(zhǎng)給藥時(shí)間等加以驗(yàn)證。

本研究的不足之處在于未能在體內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行分析，未來(lái)擬建立豬或狗等大型動(dòng)物模型并進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以更好地模擬體內(nèi)溶石，并探索內(nèi)鏡下給藥方法及其安全性。筆者的設(shè)想是采取內(nèi)鏡下經(jīng)十二指腸乳頭鼻膽囊管引流(endoscopic naso-gallbladder drainage)途徑，即于內(nèi)鏡下將導(dǎo)管經(jīng)乳頭插入膽總管，造影后將導(dǎo)絲插入膽囊管，隨后通過導(dǎo)絲將鼻膽管置入膽囊[15]。灌注藥物溶石產(chǎn)生的結(jié)石殘余可通過負(fù)壓吸引的方式吸出，以有效避免結(jié)石復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究初步闡述了醚類藥物的毒性和生物安全性與其相對(duì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系，相對(duì)分子質(zhì)量的增加雖會(huì)部分降低醚類藥物的溶石效果，但同時(shí)極大地提高了藥物的生物安全性。未來(lái)可通過化學(xué)修飾的方法進(jìn)一步優(yōu)化醚類藥物的生物安全性，同時(shí)兼顧溶石效果。目前比較成熟的修飾方法為聚乙二醇(PEG)修飾，即將活化的PEG 通過化學(xué)方法與被修飾藥物耦聯(lián)，從而改善藥物的理化特性和生物學(xué)活性，可明顯降低藥物的腸道吸收水平和血藥濃度，同時(shí)藥物分子結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致其藥代動(dòng)力學(xué)改變，藥物穩(wěn)定性增高，從而避免代謝生成毒性產(chǎn)物，最大限度地減輕不良反應(yīng)。這為新型溶石藥物的研制提供了新的理論依據(jù)。

1 劉厚寶，王越琦. 膽囊息肉及膽囊結(jié)石與膽囊癌的爭(zhēng)議與共識(shí)[J]. 中國(guó)實(shí)用外科雜志, 2014, 34 (1): 47-51.

2 Marschall HU, Einarsson C. Gallstone disease[J]. J Intern Med, 2007, 261 (6): 529-542.

3 郭偉，張忠濤. 保膽取石術(shù)尚存爭(zhēng)議的問題[J]. 中國(guó)實(shí)用外科雜志, 2015, 35 (9): 923-925.

4 Kelly E, Williams JD, Organ CH. A history of the dissolution of retained choledocholithiasis[J]. Am J Surg, 2000, 180 (2): 86-98.

5 張?jiān)疲樜撵o，鄭剛，等. 甲基叔丁基醚對(duì)大鼠臟器毒性作用[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2007， 23 (8): 953-955.

6 Nano M, Palmas F, Giaccone M, et al. Biliary reflux after cholecystectomy: a prospective study[J]. Hepatogastro-enterology, 1990, 37 (2): 233-234.

7 Wu SD, Tian Y, Kong J, et al. Possible relationship between cholecystectomy and subsequent occurrence of primary common bile duct stones: a retrospective review of data[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2007, 6 (6): 627-630.

8 Shao T, Yang YX. Cholecystectomy and the risk of colorectal cancer[J]. Am J Gastroenterol, 2005, 100 (8): 1813-1820.

9 Chen YK, Yeh JH, Lin CL, et al. Cancer risk in patients with cholelithiasis and after cholecystectomy: a nationwide cohort study[J]. J Gastroenterol, 2014, 49 (5): 923-931.

10 Salimi A, Vaghar-Moussavi M, Seydi E, et al. Toxicity of methyl tertiary-butyl ether on human blood lymphocytes[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2016, 23 (9): 8556-8564.

11 賀性鵬，蔡亞平，賀棟梁. 汽油添加劑甲基叔丁基醚對(duì)小鼠遺傳毒性的作用[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2003, 30 (1): 8-9.

12 薛惠中，王禹，高明，等. 甲基叔丁基醚職業(yè)暴露人群淋巴細(xì)胞遺傳損傷研究[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué), 2017, 29 (8): 757-761.

13 劉君，蔡端，張群華，等. 乙基叔丁醚對(duì)動(dòng)物局部和全身的毒性研究[J]. 上海醫(yī)學(xué), 1997, 20 (5): 270-272.

14 周婧婧，周慶頌，孫若飛，等. 不同分子量美沙拉嗪PEG修飾物的大鼠在體腸吸收研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016, 32 (10): 1446-1451.

15 Mori Y, Itoi T, Baron TH, et al. Tokyo Guidelines 2018: management strategies for gallbladder drainage in patients with acute cholecystitis (with videos)[J]. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2018, 25 (1): 87-95.