孫欽娟 李 琴 宛 東 盧水蓉 胥 明 鄭 萍

上海市東方醫(yī)院(同濟大學附屬東方醫(yī)院)南院消化內科(200123)

大量研究證實，細胞因子在炎癥性腸病(inflam-matory bowel disease, IBD)的發(fā)病、進展和轉歸中起重要作用。過去數(shù)十年中，相關研究已較詳盡地闡述了各類細胞因子在IBD發(fā)病中所起的作用。由T細胞分化方向所調控的不同細胞因子反應是潰瘍性 結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)發(fā)病的始動因素，CD時Th細胞主要向Th1、Th17方向分化，分泌的細胞因子以干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-17(IL-17)/IL-22為主；UC時Th細胞則主要向Th2方向分化，IL-13、IL-5分泌增加。上述疾病特異性細胞因子繼而引起腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6等細胞因子分泌，參與介導和促進炎癥反應[1]。本研究通過分析UC、CD患者與正常對照者腸黏膜中細胞因子表達的差異，以期進一步了解IBD的發(fā)病機制，為IBD的臨床診斷和治療提供參考。

材料與方法

一、研究對象

收集2014年1月—2014年12月在上海市東方醫(yī)院南院內鏡室行結腸鏡或小腸鏡檢查者的腸黏膜標本30例，包括7例正常對照者、12例UC、11例CD或疑診CD。UC和CD的診斷根據(jù)我國共識和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的診斷標準，UC嚴重程度評估采用改良Mayo評分，CD嚴重程度評估采用Best CD活動指數(shù)(CDAI)[2]。入選病例排除其他免疫性疾病、嚴重心肺疾病、腫瘤。研究方案經醫(yī)院倫理委員會審核批注，入選者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 標本采集：內鏡檢查前使用聚乙二醇電解質散進行腸道準備。IBD患者于腸道炎癥病變明顯處取活檢標本，標本采集后立即置于滅菌滅酶EP管中，以液氮罐運送至-80 ℃低溫冰箱保存。

2. 總蛋白提?。喝∵m量Western及IP細胞裂解液(碧云天生物)，在使用前數(shù)分鐘加入PMSF和Cocktail，使終濃度為1 mmol/L，置冰上備用。將保存的活檢組織剪成細小碎片，按每20 mg組織加入100～200 μL裂解液的比例加入裂解液，冰上勻漿器勻漿(15 000 r/min)，直至充分裂解。10 000～14 000×g離心3～5 min，取上清，用于細胞因子檢測。

3. 細胞因子檢測：使用Bio-Plex ProTMHuman Cytokine 27-plex Assay(Bio-Rad Laboratories, Inc.)對提取的腸黏膜組織總蛋白進行27種細胞因子檢測，包括IL-1β、IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12/p70、IL-13、IL-15、IL-17、嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF basic)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFN-γ、IFN-γ誘導蛋白-10(IP-10)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1/MCAF)、巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、MIP-1β、RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)、TNF-α、血管內皮生長因子(VEGF)。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料

對照組男性4例，女性3例，平均年齡49歲(40～62歲)；UC組男性10例，女性2例，平均年齡42歲(19～65歲)；CD組男性7例，女性4例，平均年齡34歲(15～54歲)。7例正常對照均為行結腸鏡檢查且無異常發(fā)現(xiàn)者；UC組12例患者中，輕度活動期4例，緩解期8例，2例使用激素治療，其余使用氨基水楊酸類藥物口服或灌腸治療；CD組11例患者中，輕度活動期2例，緩解期9例，5例使用激素、免疫抑制劑或生物制劑治療，其余使用氨基水楊酸類藥物治療。三組間性別構成、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、腸黏膜細胞因子表達

三組腸黏膜細胞因子檢測結果見圖1、表1。IL-5、IL-7表達在UC組、CD組中均高于對照組，IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、FGF basic、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、MIP-1α、PDGF-BB、MIP-1β、RANTES、TNF-α、VEGF表達在UC組、CD組中均低于對照組，其中UC組與對照組間、CD組與對照組間IL-1β、IL-2、IL-15、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CD組與對照組間IL-8、PDGF-BB表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余UC組與對照組間、CD組與對照組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。UC組與CD組間所有細胞因子表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；輕度活動期與緩解期UC間、輕度活動期與緩解期CD間、 輕度活動期與緩解期IBD間差異亦均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 各組腸黏膜細胞因子表達情況

表1 各組間腸黏膜細胞因子表達比較

討 論

細胞因子可分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子，促炎細胞因子主要有IL-1、IL-2、IL-6、Il-12、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、TNF-α、IFN-γ，抗炎細胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-10、IL-13。UC時以Th2型免疫反應為主，分泌的細胞因子主要有TNF-α、IL-5、IL-12、IL-13、IL-1β、IL-23、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、轉化生長因子-β(TGF-β)；CD時則發(fā)生以Th1、Th17型為主的免疫反應，主要分泌TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-12、IL-23[1]。無論是UC還是CD，TNF-α、IL-12、IL-23、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-β等的分泌均顯著增加[1,3-5]。

在眾多文獻報道的IBD相關細胞因子中，對TNF-α、IL-6、IFN-γ的研究已較為成熟，其中TNF-α單抗英夫利西單抗已廣泛應用于CD的臨床治療。IL-6由Th2細胞和巨噬細胞產生，具有廣泛的生物學作用，既能誘導Th2型免疫反應，又可促進炎癥反應[6]。IFN-γ主要由自然殺傷細胞(NK細胞)和自然殺傷T細胞(NKT細胞)分泌，主要出現(xiàn)在Th1型免疫反應中，因此其在CD患者中的表達量通常遠高于UC。本研究發(fā)現(xiàn)CD組腸黏膜IFN-γ表達確實高于UC組，但兩組間差異并無統(tǒng)計學意義，且均低于對照組，可能與本組CD患者多處于緩解期以及接受藥物治療有關。

IL-2/IL-21單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與UC呈強相關，與CD亦有中等程度的相關性[7]，臨床上多有報道IL-2在炎癥部位附近呈過表達。IL-10、TGF-β、IFN-β為抗炎細胞因子，IBD時IL-10升高在UC患者中更為明顯。TGF-β可通過上調含SH2肌醇5’-磷酸酶(SHIP)誘導內毒素耐受，減少促炎細胞因子釋放[8]。IFN-β可通過抑制IL-13產生抑制UC炎癥[9]。IL-12/IL-23兩者共享亞基和受體亞基，作用為促使Th0細胞向Th1、Th17方向分化，從而誘發(fā)和維持炎癥，UC和CD時兩者表達均明顯升高[10]。IL-17是由Th17細胞分泌的促炎細胞因子，研究[11]發(fā)現(xiàn)IL-17A在CD中具有促纖維化作用，與CD狹窄型疾病行為有關。然而本研究中IL-12、IL-17在各組腸黏膜中的表達差異并無統(tǒng)計學意義。

IL-13主要來源于Th2型免疫反應，CD時其表達水平應低于UC。研究[9]發(fā)現(xiàn)以IFN-β抑制IL-13產生可誘導UC患者臨床應答和緩解。IL-4主要由激活的淋巴細胞合成，可抑制促炎細胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α產生，并抑制淋巴細胞、單核巨噬細胞活化和移動，抑制超氧化物陰離子形成。一些研究發(fā)現(xiàn)UC患者腸黏膜IL-4分泌細胞數(shù)量減少，IL-4 mRNA和蛋白表達均明顯下調，提示IL-4與UC發(fā)病有關[12]。另有研究[13]報道，在UC和CD活動期，IL-4可使升高的外周血單核細胞VEGF產生回復至正常水平。本研究中UC、CD患者的腸黏膜IL-13、IL-4表達水平與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義。

本研究分析發(fā)現(xiàn)UC和CD患者腸黏膜IL-1β、IL-2、IL-15、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β表達顯著低于正常對照者，其中IL-1β、IL-2屬于促炎細胞因子，IL-15在IBD中起促炎還是抗炎作用則尚存爭議[14]。IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β均為體內重要的趨化因子，能誘導炎癥細胞向炎癥部位遷移、浸潤。MCP-1能募集單核巨噬細胞和T細胞聚集至炎癥部位，其受體為CCR2，IL-1可誘導外周血單個核白細胞表達、分泌MCP-1[15-16]。IP-10為IFN-γ誘導蛋白，IFN-γ可誘導單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞分泌IP-10，促使T細胞黏附于內皮細胞并抑制新生血管生成[17]。MIP-1α、MIP-1β亦對T細胞和單核巨噬細胞具有趨化作用，其受體為CCR5，主要表達于粒細胞、巨噬細胞、未成熟樹突細胞、CD8+T細胞和CD4+T細胞[18]。既往研究[19]顯示，多形核中性白細胞產生的MIP-1α、MIP-1β對皮膚肉芽腫形成過程中巨噬細胞的募集具有重要作用。目前國內外尚未見關于IP-10、MIP-1α、MIP-1β在IBD中作用的研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CD患者腸黏膜IL-8、PDGF-BB表達顯著低于正常對照者，提示兩者可能在UC與CD的鑒別中有一定意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸黏膜中IL-1β、IL-2、IL-15、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β表達較正常對照者顯著下調，CD患者腸黏膜中IL-8、PDGF-BB表達亦顯著下調，提示這些細胞因子可能在IBD發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用，為進一步探討細胞因子在IBD中的作用提供了依據(jù)。本研究所檢測的大部分細胞因子的腸黏膜表達水平在IBD患者中低于正常對照者，可能與本組大部分患者處于緩解期且有部分患者使用免疫抑制劑和生物制劑治療有關。本研究的局限性主要在于：①僅檢測腸黏膜細胞因子表達，其表達水平可能受取材部位、腸道內環(huán)境等因素影響；②IBD患者樣本量小且包括初發(fā)、復發(fā)、緩解期等各階段患者，既往治療方案亦各不相同，可能影響腸黏膜細胞因子表達水平。后續(xù)擬累積樣本量、根據(jù)病情嚴重程度分組并同時行血清細胞因子檢測，以進一步明確IBD患者的細胞因子表達變化及其與疾病進程的關系。

1 Strober W, Fuss IJ. Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases[J]. Gastroenterology, 2011, 140 (6): 1756-1767.

2 中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病學組. 炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)[J]. 胃腸病學, 2012, 17 (12): 763-781.

3 Caruso R, Sarra M, Stolfi C, et al. Interleukin-25 inhibits interleukin-12 production and Th1 cell-driven inflammation in the gut[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (7): 2270-2279.

4 Rovedatti L, Kudo T, Biancheri P, et al. Differential regulation of interleukin 17 and interferon gamma production in inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2009, 58 (12): 1629-1636.

5 Kotlarz D, Beier R, Murugan D, et al. Loss of interleukin-10 signaling and infantile inflammatory bowel disease: implications for diagnosis and therapy[J]. Gastroenterol-ogy, 2012, 143 (2): 347-355.

6 Li Y, de Haar C, Chen M, et al. Disease-related expression of the IL6/STAT3/SOCS3 signalling pathway in ulcerative colitis and ulcerative colitis-related carcino-genesis[J]. Gut, 2010, 59 (2): 227-235.

7 Festen EA, Goyette P, Scott R, et al. Genetic variants in the region harbouring IL2/IL21 associated with ulcerative colitis[J]. Gut, 2009, 58 (6): 799-804.

8 Sly LM, Rauh MJ, Kalesnikoff J, et al. SHIP, SHIP2, and PTEN activities are regulatedinvivoby modulation of their protein levels: SHIP is up-regulated in macrophages and mast cells by lipopolysaccharide[J]. Exp Hematol, 2003, 31 (12): 1170-1181.

9 Mannon PJ, Hornung RL, Yang Z, et al. Suppression of inflammation in ulcerative colitis by interferon-β-1a is accompanied by inhibition of IL-13 production[J]. Gut, 2011, 60 (4): 449-455.

10 Cho JH, Brant SR. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2011, 140 (6): 1704-1712.

11 Biancheri P, Pender SL, Ammoscato F, et al. The role of interleukin 17 in Crohn’s disease-associated intestinal fibrosis[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2013, 6 (1): 13.

12 崔海宏，陳村龍，楊玉捷，等. 潰瘍性結腸炎患者腸黏膜Th1/Th2類細胞因子mRNA的表達[J]. 世界華人消化雜志, 2003, 11 (10): 1524-1527.

13 Griga T, Hebler U, Voigt E, et al. Interleukin-4 inhibits the increased production of vascular endothelial growth factor by peripheral blood mononuclear cells in patients with inflammatory bowel disease[J]. Hepatogastroenterology, 2000, 47 (36): 1604-1607.

14 Tosiek MJ, Fiette L, El Daker S, et al. IL-15-dependent balance between Foxp3 and RORγt expression impacts inflammatory bowel disease[J]. Nat Commun, 2016, 7: 10888.

15 Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview[J]. J Interferon Cytokine Res, 2009, 29 (6): 313-326.

16 Yoshimura T, Yuhki N, Moore SK, et al. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Full-length cDNA cloning, expression in mitogen-stimulated blood mononuclear leukocytes, and sequence similarity to mouse competence gene JE[J]. FEBS Lett, 1989, 244 (2): 487-493.

17 Meng X, Gao W, Tang Y, et al. Alterations of Serum IP-10 and TARC in Patients with Early Acute Rejection after Liver Transplantation[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 41 (3): 1063-1071.

18 Mack M, Cihak J, Simonis C, et al. Expression and characterization of the chemokine receptors CCR2 and CCR5 in mice[J]. J Immunol, 2001, 166 (7): 4697-4704.

19 von Stebut E, Metz M, Milon G, et al. Early macrophage influx to sites of cutaneous granuloma formation is dependent on MIP-1alpha /beta released from neutrophils recruited by mast cell-derived TNFalpha[J]. Blood, 2003, 101 (1): 210-215.