高華，陳明，裴靜，陳方方，潘燕，孔祥鋒

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，具有較高的猝死風(fēng)險(xiǎn)，其主要病理機(jī)制為腦內(nèi)神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致腦功能短暫性障礙［1］。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，全球約有7 000萬(wàn)例癲癇患者，以中低收入國(guó)家為主，兒童、青少年多見［2-3］。在我國(guó)，癲癇患者有900萬(wàn)例左右，且每年有1‰～2‰的患者因癲癇猝死［4-5］。目前癲癇的治療仍以藥物治療為主，大部分患者服用抗癲癇藥物后效果良好，但仍有20%～30%的患者對(duì)抗癲癇藥物不敏感［6］，被稱為耐藥性癲癇［7］。耐藥性癲癇不僅損傷患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)，增加患者骨折或骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期癲癇還會(huì)引起患者精神心理問題，如焦慮、抑郁、認(rèn)知功能下降等，在一定程度上增加患者自殺、意外事故死亡風(fēng)險(xiǎn)［8］。

有研究顯示，遺傳基因多態(tài)性可能參與抗癲癇藥物進(jìn)入機(jī)體后的反應(yīng)過程［7］。ABCB1基因（也稱為多藥耐藥蛋白1）編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白可對(duì)抗癲癇藥物在體內(nèi)分布以及腸內(nèi)吸收過程產(chǎn)生一定影響，P糖蛋白（P-gp）是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類ABCB蛋白［9-11］，其水平變化與ABCB1基因C3435T位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)［12］。新疆地區(qū)民族分布具有一定特點(diǎn)，形成了與地域、民族相關(guān)的疾病，本研究旨在探討ABCB1基因C3435T位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族人群癲癇及耐藥性的關(guān)系，為新疆維吾爾族癲癇患者的治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡 ＞ 14歲；（2）至少有2次間隔24 h以上、發(fā)作明確的非誘發(fā)性癲癇樣發(fā)作；（3）行腦電圖（EEG）、顱腦CT或核磁共振成像（MRI）檢查排除進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和占位性病變者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有癲癇或高熱驚厥病史；（2）無(wú)癲癇家族史。

1.2 研究對(duì)象 選取2017年新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院收治的住院或門診維吾爾族癲癇患者98例作為癲癇組，其中耐藥性癲癇患者38例，非耐藥性癲癇患者60例，耐藥性癲癇的診斷參照2010年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟制定的耐藥性癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)［13］；另選取同期在本院體檢健康的維吾爾族志愿者100例作為對(duì)照組。癲癇組患者中男50例，女48例；年齡18～77歲，平均年齡（41.3±12.8）歲。對(duì)照組受試者中男50例，女50例；年齡2～67歲，平均年齡（45.8±10.1）歲。對(duì)照組與癲癇組受試者性別（χ2=0.021）、年齡（t=3.368）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。耐藥性癲癇患者中男20例，女18例；年齡19～75歲，平均年齡（43.3±15.1）歲。非耐藥性癲癇患者中男32例，女28例；年齡18～77歲，平均年齡（40.0±11.0）歲。耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者性別（χ2=0.064）、年齡（t=2.683）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，所有受試者簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采取兩組受試者外周靜脈血2 ml，采用天根生化科技（北京）有限公司DNA提取試劑盒（天根基離心柱型）進(jìn)行DNA的提取，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.2 基因多態(tài)性檢測(cè) （1）引物設(shè)計(jì)：ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的引物序列為 F：5'-GTTTTCAGCTGCTTGATGGCA-3'，R：5'-AAGGGTGTGATTTGGTTGCT-3'。（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體系：樣本 DNA 2 μl，dNTP 200 μmol，MgCl21.5 mmol， 上 下 游 引 物 各 1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 U，ddH2O 8.5 μl，終體積為 25 μl。（3）PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 35 s，53 ℃退火 35 s，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸10 min。（4）選取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中180 V，電泳15 min觀察條帶。（4）選取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行直接測(cè)序并與ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。遺傳平衡檢驗(yàn)采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 癲癇組和對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2值分別為3.111、1.601；P值分別為0.078、0.996）。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及直接測(cè)序分析 ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與理論值基本一致，見圖1。癲癇組和對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)經(jīng)直接測(cè)序后均存在CC、CT、TT 3種基因分型。

2.3 癲癇組和對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率 癲癇組和對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)的基因型、等位基因分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 癲癇組與對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of genotypes and allele frequency of ABCB1 gene C3435T locus between epilepsy group and control group

圖1 ABCB1基因C3435T位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 The electrophoresis of PCR product of ABCB1 C3435T

2.4 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allele frequency of ABCB1 gene C3435T locus in patients with drug-resistant epilepsy or not

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以藥物治療為主，但患者對(duì)抗癲癇藥物（包括卡馬西平、丙戊酸、苯巴比妥等）耐藥是影響藥物治療效果的主要原因之一。有研究顯示，癲癇患者耐藥可增加癲癇發(fā)作次數(shù)、相關(guān)并發(fā)癥和死亡風(fēng)險(xiǎn)［14-15］。目前，耐藥癲癇的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要學(xué)說(shuō)為轉(zhuǎn)運(yùn)體假說(shuō)和靶點(diǎn)假說(shuō)［16-17］。

既往研究表明，P-gp水平及其功能均受到ABCB1基因多態(tài)性的影響［17-18］。P-gp可將細(xì)胞內(nèi)部分代謝產(chǎn)物和部分藥物分子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低?？R西平、苯妥英鈉等抗癲癇藥物均可作為P-gp底物，促進(jìn)其水平升高［19］，進(jìn)而影響藥物吸收?；贏BCB1基因C3435T位點(diǎn)與P-gp相關(guān)、腦內(nèi)P-gp過量表達(dá)可促進(jìn)抗癲癇藥物的排出及ABCB1基因被證實(shí)與部分藥物（如地高辛［20］、環(huán)孢素［21］和非索那定［22］）藥代動(dòng)力學(xué)存在交互作用，推測(cè)基因多態(tài)性可能是產(chǎn)生癲癇耐藥的重要機(jī)制之一［23］。遺傳學(xué)研究結(jié)果顯示，ABCB1基因中常見遺傳變異與癲癇的耐藥性相關(guān)，尤其是C3435T（rs1045642）位點(diǎn)多態(tài)性備受關(guān)注［24-25］。單核苷酸C3435T同義突變指外顯子26的3435位點(diǎn)上C轉(zhuǎn)化為T，其與P-gp水平及藥物反應(yīng)相關(guān)［26］。近年有關(guān)ABCB1基因C3435T位點(diǎn)多態(tài)性與耐藥性癲癇的相關(guān)性研究報(bào)道較多，但研究結(jié)果并不一致［27-29］。分析上述研究結(jié)果不一致的原因可能與選取的研究對(duì)象不同和疾病進(jìn)展或患者自身因素導(dǎo)致抗癲癇藥物進(jìn)入減少或耐受性增加有關(guān)［30-31］。

新疆是維吾爾族人群主要聚集地，其民俗保持了較好的同質(zhì)性，且多為同民族間聯(lián)姻，遺傳穩(wěn)定性較好，故本研究選取新疆維吾爾族人群為研究對(duì)象，結(jié)果顯示，癲癇組和對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)經(jīng)直接測(cè)序后均存在CC、CT、TT 3種基因分型，與既往國(guó)內(nèi)外關(guān)于癲癇基因分型研究的結(jié)果一致［24］。本研究結(jié)果還顯示，癲癇組和對(duì)照組受試者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率間無(wú)差異，耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示ABCB1基因C3435T位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族人群癲癇易感性及耐藥性癲癇的發(fā)生無(wú)關(guān)，與既往部分研究結(jié)果相一致［27］。

綜上所述，ABCB1基因C3435T位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族人群癲癇易感性及耐藥性癲癇的發(fā)生無(wú)關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：孔祥鋒進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)；高華進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；陳明、裴靜、陳方方進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；潘燕進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。