高涵，吳琦，陳宏月，郭紅艷，周濤，劉哲丞

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161041

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡稱肝癌，是目前臨床上最常見的癌癥之一[1]。肝癌嚴重威脅人類的健康，其發(fā)病率和病死率也在不斷增加，在全世界，每年肝癌的新發(fā)病率居惡性腫瘤中的第5位，病死率居第3位。因此，植物的抗癌成分越來越受到人們的極大關(guān)注。人參皂苷（ginsenoside）是人參的主要活性成分之一，在癌癥的預(yù)防和治療中被極度重視和廣泛研究，然而人參皂苷對癌癥的作用機制是十分復(fù)雜的[2]。人參皂苷Rh2包括20(S)和20(R)兩種構(gòu)型，20（S）-人參皂苷Rh2比20（R）-人參皂苷Rh2更具有顯著的抗癌作用，能夠抑制細胞增殖并且引起人肝癌HepG2細胞G1期阻滯[3]。20（R）和20（S）人參皂苷Rh2都具有抗癌作用[4],并且使得caspase-3活性增強，誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡。目前，肝癌的病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，但從腫瘤細胞學(xué)來看，肝癌發(fā)生的本質(zhì)在于細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)失控[5]。近年來中藥的抗癌機制研究取得了很大進展，尤其對肝癌細胞增殖周期的調(diào)控與誘導(dǎo)細胞凋亡兩方面內(nèi)容[6]。該研究旨在觀察人參皂苷Rh2與肝癌細胞的自噬和凋亡，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

肝癌HepG2細胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗中心饋贈。20（S）-人參皂苷Rh2由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室分離制備。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，美國）、粉（Gibco公司，美國），0.25%EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。兔抗鼠caspase-8/9、beclin-1、LC3（Santa Cruz公司）。Cy3熒光抗體、FITC抗體（康威試劑公司）。倒置熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 細胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清、丙酮酸鈉（20 000 U/L）、谷氨酰胺（20 000 U/L）、青霉素（200 000 U/L）和鏈霉素（0.02 g/L）的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)肝癌HepG2細胞，隔天換液，用胰蛋白酶消化后進行傳代。

1.3 免疫熒光實驗

用不同濃度的20（S）-人參皂苷Rh2作用于肝癌HepG2細胞后，HepG2細胞用95%乙醇室溫下固定10 min，使用PBS清洗3次。加入1 mL的0.1%TritonX-100于培養(yǎng)皿中，室溫下處理10 min，PBS清洗3次。將1 mL的1%BSA加入培養(yǎng)皿，37°C封閉1 h。將兔抗鼠caspase-8/9和beclin-1、LC3蛋白抗體按照1:200稀釋滴加在樣品上，放入4°C冰箱過夜。加入熒光Cy3或FITC標記的二抗，4°C冰箱過夜。加入DAPI染色液（1:500稀釋）室溫孵育5 min，用PBS清洗。通過熒光顯微鏡（Olympu）觀察HepG2細胞并拍照。每個實驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

為了進一步證實20（S）-人參皂苷Rh2對自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3表達的影響，以及caspase-8介導(dǎo)的膜受體途徑和caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑，從而誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用機制，將20μg/mL的20（S）-人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞，作用不同時間，分別用caspase-8/9抗體、自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3抗體，做雙染色免疫熒光分析。熒光Cy3標記caspase-8/9抗體，二抗對應(yīng)一抗；熒光FITC標記LC3和Beclin-1抗體，二抗對應(yīng)一抗。

20（S）-人參皂苷Rh2作用HepG2細胞3 h后，HepG2細胞caspase-8的活性和Beclin-1的熒光強度表達水平顯著升高。見圖1。

圖1 20（S）-人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞3 h caspase-8活性與Beclin-1表達的關(guān)系(×200)

20（S）-人參皂苷Rh2作用HepG2細胞3 h后，HepG2細胞caspase-9的活性和LC3的熒光強度增強，且兩者相近，說明caspase-9活性和LC3表達無顯著變化。見圖2。

圖2 20（S）-人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞3 h caspase-9活性與LC3表達的關(guān)系(×200)

3 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及多因素、多基因的變化，多階段、多步驟的演變[7]。迄今為止，肝癌的病因和發(fā)病機制尚未充分闡明。從腫瘤細胞學(xué)來看，腫瘤的發(fā)生不僅與加速度腫瘤細胞增殖有關(guān)，而且與抑制腫瘤細胞死亡密切相關(guān)[8]。經(jīng)過100多年的研究，人們將細胞的死亡方式分為兩類：非程序性細胞死亡和程序性細胞死亡 （programmed cell death，PCD）。非程序性細胞死亡稱為壞死（necrosis），它是細胞被動死亡的過程，在大多數(shù)情況下不受細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的控制[9]。程序性細胞死亡不同于壞死，壞死主要由細胞內(nèi)基因組的調(diào)節(jié)，其最重要的形態(tài)學(xué)特征是細胞膜和核膜的完整性。目前，研究表明，程序性細胞死亡（PCD）包括細胞凋亡和自噬性細胞死亡兩類，自噬引起的細胞死亡稱為Ⅱ型PCD，凋亡稱為Ⅰ型PCD[10]。

促進腫瘤細胞死亡是治療腫瘤的方法之一。隨著自噬研究的深入，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和消亡中的作用越來越受到關(guān)注[11]。在抗癌藥物的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中充分認識并合理利用腫瘤的自噬、凋亡和溶酶體陽性因子，調(diào)整腫瘤細胞自身的死亡機制[12]，有助于彌補甚至突破現(xiàn)有抗腫瘤藥物的缺陷和不足，促進腫瘤研究及其相關(guān)學(xué)科的共同發(fā)展。

腫瘤是最早發(fā)現(xiàn)的與自噬有關(guān)的疾病之一[13]，自噬的異常調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，參與自噬調(diào)控的基因被命名為自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG），進化比較保守[14]。自噬過程的調(diào)控機制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明。Beclin-1和LC3是自噬相關(guān)蛋白編碼的基因。目前關(guān)于自噬與腫瘤關(guān)系的研究已引起人們廣泛關(guān)注，但關(guān)于自噬與肝癌的報道卻很少。熊燚[15]研究顯示在其通路中細胞色素C從線粒體釋放到細胞漿中與胱天蛋白酶-9（caspase-9）結(jié)合形成凋亡體，激活caspase-9后進一步激活caspase-3，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。還有報道，人參皂苷Rh2通過上調(diào)肝癌細胞SK-Hep-1中促凋亡蛋白激酶（PKC）活性可有效促進細胞色素C從線粒體釋放并且激活caspase-3，促進線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進肝癌細胞凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn),抗癌藥物可以激活JNK通路，通過激活上游腫瘤細胞自噬轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和Beclin-1蛋白表達水平[16]。

生物學(xué)發(fā)展研究證實，凋亡作為調(diào)控機制在多細胞生物的正常發(fā)育中起著重要的作用。病理學(xué)研究顯示，細胞凋亡是許多疾病的基礎(chǔ)，細胞凋亡和逃逸是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一。細胞凋亡是由基因控制的細胞活動，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是一種重要機制。caspase是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶，以酶原的形式存在于細胞質(zhì)中，經(jīng)兩次切割后被激活，細胞凋亡依賴于caspase的活化。caspase根據(jù)不同的分子結(jié)構(gòu)和功能可分為：caspase-l/4/5/13/14，主要參與炎癥反應(yīng)；caspase-2/8/10，參與caspase級聯(lián)反應(yīng)的啟動過程；caspase-3/6/7，是凋亡的直接執(zhí)行者。蛋白酶家族中與凋亡相關(guān)的酶主要是caspase-8、caspase-9和caspase-3等，它們的激活主要是通過膜受體途徑和線粒體途徑介導(dǎo)[17]。

該研究旨在進一步探討肝癌的發(fā)生、發(fā)展及人參皂苷Rh2是否通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3的表達而誘導(dǎo)凋亡，將20μg/mL人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞不同的時間，然后進行免疫熒光分析。研究結(jié)果顯示，與對照組HepG2細胞相比，20（S）-人參皂苷Rh2作用組Beclin-1在1～4 h內(nèi)明顯升高（P＜0.05），但LC3在各時間點的表達無明顯變化（P＞0.05）。通過免疫熒光分析，人參皂苷Rh2作用3 h后，caspase-8活性明顯升高，Beclin-1表達水平明顯增強，熒光標記的LC3表達無明顯變化。以上實驗證實，人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用主要通過膜受體途徑調(diào)節(jié)caspase-8實現(xiàn)，或可能與Beclin-1的表達有關(guān)，其作用有時間依賴性。然而，通過電子顯微鏡觀察結(jié)果，只有典型的細胞凋亡的特點，在第一、二期有典型急性左心衰合并肺感染診斷標準的凋亡小體；在第三、四期自噬過程中形成的凋亡體和吞噬體未見。因此，人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用是否與自噬有關(guān)，還有待進一步的實驗和研究。