王 澍，馮 力，李 倩，杜 鵑

（西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明650224）

Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物抵御鹽脅迫過(guò)程中起著非常重要的作用［1］。質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)Na＋的外排，將細(xì)胞質(zhì)中的Na＋逆向運(yùn)送到胞外高Na＋環(huán)境中，保持細(xì)胞中Na＋的平衡，防止Na＋對(duì)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的傷害［2］。近幾年，一些植物包括黃瓜（Cucumis sativus）［3］、錦葵（Malva Sinensis Cavan）［4］、唐古特白刺（Nitraria tangtaorum）［5］、菊花（Dendranthema morifolium）［6］、長(zhǎng)葉紅砂（Reaumuria trigyna）［7］的質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等都已被克隆和鑒定。

一些竹類(lèi)植物具有一定的耐鹽性包括剛竹（Phyllostachys viridis）、白哺雞竹（Ph．dulcis McClure）、早竹（Ph．praecox）、紅竹（Ph．iridescins）、淡竹（Ph．glauca McClure）等［8－12］。云南竹類(lèi)資源最為豐富，中華大節(jié)竹（Indosasa sinica）在云南河口天然竹林的面積約為8 580 hm2，開(kāi)發(fā)潛力很大。竹子耐鹽性研究起步較晚，但在鹽脅迫生理、耐鹽性鑒定和耐鹽品種篩選等方面取得了一定成果［13］。課題組前期研究表明中華大節(jié)竹具有一定的耐鹽性，該文根據(jù)質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的保守序列設(shè)計(jì)引物，首次利用RACE方法克隆出了中華大節(jié)竹質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，同時(shí)命名為IsSOS1，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為開(kāi)發(fā)和利用竹類(lèi)植物耐鹽基因資源提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

中華大節(jié)竹（Indosasa sinica）來(lái)源于昆明世博園，取母竹并移植于西南林業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)。用150 mmol·L－1NaCl處理幼苗3 h，取中華大節(jié)竹的根、莖和葉，迅速用液氮速凍，并保存于－70℃冰箱中，用于RNA的提取。

1.2 質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆

用OMEGA公司的植物RNA試劑盒，提取中華大節(jié)竹幼苗（根、莖和葉）的總RNA。混合RNA后，用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Takara）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA待用。

根據(jù)擬南芥和水稻等模式植物的SOS1基因序列，根據(jù)其保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1（表1）。以反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL：cDNA模板為1.0μL，上和下游引物（10μmol·L－1）分別為1μL，10×Buffer（Mg2＋）為5μL，dNTPs Mixture（10 mmol·L－1）為4μL，ExTaq DNA聚合酶（5 U·μL－1）為0.5μL，最后補(bǔ)37.5μL的滅菌水。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件見(jiàn)表1，通過(guò)PCR的擴(kuò)增，獲得了約700 bp的中間片段，測(cè)序后把該基因片段序列在NCBI網(wǎng)站中，進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示該片段與水稻和擬南芥的SOS1基因序列較高的同源性。

參照RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）試劑盒中已知的引物，根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)特異引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE的擴(kuò)增，通過(guò)巢式PCR分別獲得3′和5′片段。3′片段和5′片段PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。純化后的PCR產(chǎn)物連接載體（pMD-19T）后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行測(cè)序。用Vector NTI 12軟件拼接中間、3′和5′片段，獲得了IsSOS1基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接出的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2通過(guò)PCR擴(kuò)增（表1），PCR擴(kuò)增后獲得含有IsSOS1基因全長(zhǎng)編碼框的cDNA序列。

表1 引物序列及PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Tab.1 Primer sequences and condition for PCR

1.3 IsSOS1基因的生物信息學(xué)分析

用vector NTI 12軟件對(duì)IsSOS1基因序列分析、拼接、ORF識(shí)別和蛋白質(zhì)翻譯，用DNAMAN5.2軟件完成氨基酸序列比對(duì)，并通過(guò)Mega4.1軟件（Neighbor-Joining方法）構(gòu)建同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)，用ProtParam軟件（http：／／web.expasy.org）對(duì)其進(jìn)行蛋白組分析。用TMpred程序（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED_form.html）對(duì)氨基酸跨膜進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IsSOS1基因的cDNA克隆

本文利用RACE技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1（表1），以中華大節(jié)竹（Indosasa sinica）mRNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA第1鏈為擴(kuò)增模板，經(jīng)過(guò)PCR的擴(kuò)增獲得約700 bp基因片段。設(shè)計(jì)特異引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE的擴(kuò)增，通過(guò)巢式PCR分別獲得3′和5′片段。用Vector NTI 12軟件拼接中間、3′和5′片段，獲得了IsSOS1基因全長(zhǎng)cDNA序列。設(shè)計(jì)特異引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2（表1）通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為3 516 bp的cDNA序列。Vector NTI 12軟件分析結(jié)果顯示，該全長(zhǎng)序列包含3 105 bp的開(kāi)放閱讀框，同時(shí)編碼1 035個(gè)氨基酸殘基，該序列含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。

2.2 生物信息學(xué)分析

用ProtParam ExPASy（http：／／web.expasy.org）軟件對(duì)其進(jìn)行蛋白組分析，顯示IsSOS1推測(cè)分子式C5219H8259N1417O1511S43，分子量為11.64 kDa，總正電殘基（Arg＋Lys）為102，總負(fù)電殘基（Asp＋Glu）為108，等電點(diǎn)為pI＝6.52，理論推導(dǎo)半衰期為30 h。

通過(guò)TMPRED program軟件進(jìn)行跨膜分析，結(jié)果顯示IsSOS1包含9個(gè)跨膜片段（圖1）。IsSOS1氨基酸序列與擬南芥AtSOS1和水稻OsSOS1的氨基酸序列同源性較高，同源性分別為50.3%和76.63%（圖2）。

圖1 IsSOS1跨膜區(qū)分析Fig.1 Tranmembrane analysis of protein IsSOS1

圖2 IsSOS1氨基酸序列與擬南芥和水稻氨基酸序列的比對(duì)分析Fig.2 Amino acid sequence analysis of IsSOS1 compared to Arabidopsis（AtSOS1）and rice（OsSOS1）

2.3 IsSOS1蛋白進(jìn)化樹(shù)分析

用中華大節(jié)竹的IsSOS1序列在NCBI中進(jìn)行Blast（圖3）。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，Is SOS1氨基酸序列與禾本科植物（水稻和蘆葦）質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SOS1）的序列同源性較高，同時(shí)也顯示Is SOS1與液泡型的Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性而質(zhì)與膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系近（圖3）。

圖3 不同種類(lèi)植物的質(zhì)膜型SOS1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenic analysis of SOS1 genes from different plant species

3 結(jié)論與討論

通過(guò)RACE方法從中華大節(jié)竹中克隆了質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為IsSOS1（基因登錄號(hào)：KC113048）。IsSOS1序列分析結(jié)果顯示，IsSOS1的全長(zhǎng)為3 516 bp，其中開(kāi)放讀碼框?yàn)? 105 bp，編碼了1 035個(gè)氨基酸多肽。其分子量為11.64 kDa，pI（等電點(diǎn)）＝6.52。氨基酸同源性和聚類(lèi)分析證實(shí)，氨基酸同源性和聚類(lèi)分析證實(shí)，IsSOS1氨基酸序列與擬南芥AtSOS1和水稻OsSOS1的氨基酸序列同源性較高，分別為50.3%和76.63%，但是與液泡型的Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列同源性較低。

通過(guò)TMPRED program軟件進(jìn)行跨膜分析，結(jié)果顯示IsSOS1包含9個(gè)完全跨膜片段，這與其它研究報(bào)道的結(jié)果不同［10］。另外，IsSOS1蛋白序列的5′端缺失較多的一段蛋白，這樣的缺失推測(cè)可能影響該基因的功能，鑒于IsSOS1蛋白序列特性，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)展酵母互補(bǔ)功能表達(dá)分析，對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證研究。同時(shí)，云南竹子資源豐富，我們推測(cè)不同竹類(lèi)植物屬間的IsSOS1蛋白序列可能有差異，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致其功能的差異。應(yīng)該繼續(xù)深入研究，為利用IsSOS1逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因并利用轉(zhuǎn)基因方法提高植物抗鹽性，培育抗鹽作物品種提供新途徑。