董曉斐 丁小玉 賀佳幸 屈波

【摘要】目的 探討TLR4-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)β-catenin的變化及護(hù)心康的干預(yù)作用。方法 SPF級(jí)TLR4-/-小鼠共70只，隨機(jī)取12只為對(duì)照組，予以普通飼料喂養(yǎng);其余58只予以高脂飼料造模，喂養(yǎng)13周后從造模動(dòng)物中隨機(jī)選取5只解剖觀察其胸主動(dòng)脈，光鏡下發(fā)現(xiàn)粥樣斑塊為造模成功。造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、護(hù)心康組、阿托伐他汀組，Wnt抑制劑WIF組，每組12只，分別予以相應(yīng)處理。治療八周后處死小鼠，心臟采血，酶比色法檢測(cè)血脂;取胸主動(dòng)脈，光鏡下觀察動(dòng)脈粥樣硬化形成情況;免疫組化法檢測(cè)斑塊中β-catenin蛋白的表達(dá)。結(jié)果 ①血脂檢測(cè) 造模后動(dòng)物膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平比正常組明顯升高（P<0.05）;阿托伐他汀和護(hù)心康可以降低膽固醇和低密度脂蛋白水平（P<0.05），WIF對(duì)二者的降低作用不明顯;三種藥物對(duì)甘油三酯和高密度脂蛋白的影響相對(duì)較小。②光鏡觀察：正常組無(wú)斑塊形成，模型組可見(jiàn)內(nèi)膜增厚，大量斑塊明顯形成，血管腔明顯減小;各藥物干預(yù)組斑塊病變相對(duì)較輕。③β-catenin蛋白表達(dá)：模型組中β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P<0.01）;與模型組相比，三種藥物均能降低β-catenin，Wnt抑制劑WIF降低作用較強(qiáng)（P<0.01），護(hù)心康組和阿托伐他汀組也有明顯的降低作用（P<0.05）;WIF降低β-catenin的作用較阿托伐他汀強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)論 TLR4-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)β-catenin表達(dá)明顯升高，護(hù)心康能降低血脂和β-catenin在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)，從而可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

【關(guān)鍵詞】護(hù)心康;TOLL樣受體4基因敲除小鼠;動(dòng)脈粥樣硬化;β-連環(huán)蛋白

【中圖分類(lèi)號(hào)】360.10 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2018.36..04

【Abstract】Objective To investigate the changes of β-catenin and the intervention of Huxinkang in atherosclerosis.Methods 70 SPF TLR4-/-mice were fed， and 12 mice of them were randomly selected as control group and fed with normal diet.The remaining 58 mice were modeled with high-fat diet. After 13 weeks of feeding，5 mice were randomly selected from them to observe the thoracic aorta， and atheroma plaque was found under light microscopy indicating successful modeling. The successful model animals were randomly divided into model group，Huxin Kang group，atorvastatin group，and Wnt inhibitor WIF group，10 in each group， which were treated accordingly.Eight weeks after the treatment，the mice were sacrificed and the thoracic aorta was taken. The formation of atherosclerosis was observed under light microscope.The expression of β-catenin proteins in plaques was detected by immunohistochemistry.Results ①Blood lipid test： The levels of cholesterol， triglyceride， low-density lipoprotein and high-density lipoprotein in the animals were significantly higher than those in the normal group （P<0.05）. Atorvastatin and Huxinkang can lower cholesterol and low-density lipoprotein levels （P<0.05）， and WIF has no significant effect on the reduction of the two; the effects of three drugs on triglyceride and high-density lipoprotein are relatively small.②Light microscopy： no plaques were formed in the wild group. A large number of plaques were formed in the model group， and the intima thickened ，so the vascular lumen was significantly reduced;，but he plaque lesions in each drug intervention group were relatively light. ③β-catenin protein expression： The expression of β-catenin protein in the model group was significantly higher than that in the normal group （P<0.01）. Compared with the model group， the three drugs could reduce β-catenin， and the Wnt inhibitor had a stronger WIF （P<0.01）. The Huxinkang group and the atorvastatin group also had significant reduction （P<0.05）;the effect of WIF on β-catenin was stronger than that of atorvastatin （P<0.05）.Conclusion The expression of β-catenin was significantly increased in TLR4-/- mice with atherosclerosis.The Huxinkang can reduce the expression of blood lipids and β-catenin in atherosclerosis， which can reduce the formation of atherosclerosis.

【Key words】Huxinkang;TLR4-/-Mice;Atherosclerosis;β-catenin

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前研究表明有很多誘發(fā)因素與之相關(guān)，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)與血脂代謝紊亂有關(guān)，尤其是高脂血癥的存在[1]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)：Wnt信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病密切相關(guān)[2]，可能成為控制動(dòng)脈粥樣硬化的新型靶點(diǎn)。TOLL樣受體4（TOLL-like receptor 4，TLR4）激活可以介導(dǎo)AS血管壁炎癥，抑制TLR4是否會(huì)影響Wnt信號(hào)的表達(dá)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。既往研究表明，護(hù)心康對(duì)AS的防治具有較好的療效，本研究通過(guò)TLR4-/-小鼠AS模型，觀察Wnt信號(hào)通路中β-catenin的變化及護(hù)心康的干預(yù)作用，探討護(hù)心康防治AS的作用機(jī)制，為AS的治療及臨床用藥提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)TLR4基因敲除小鼠70只，6周齡，（20.3±2.5）g，雄性，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：201800971.普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料由上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)提供，動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有研究人員均人道地進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)倫理?xiàng)l例。

1.2 藥物

阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408）。護(hù)心康片（湖南省中醫(yī)研究院附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)為（湘）衛(wèi)藥劑（2003）12第039號(hào)），由瓜蔞皮、薤白、陳皮、遠(yuǎn)志、法半夏、茯苓、蓽澄茄、石菖蒲、旋覆花、隔山消、苦杏仁、茜草、三七、丹參、蒲黃、五靈脂、琥珀、北山楂、葳蕤、黃芪、炙甘草等組成，每片含生藥0.3 g。

1.3 主要試劑與儀器

膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)儀器cobas8000全自動(dòng)生化分析儀由羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司提供;β-catenin兔抗小鼠單克隆抗體、PV-6002羊抗小鼠IgG/HRP聚合物由美國(guó)GBI公司提供;WIF由美國(guó)R&D公司提供;Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝影系統(tǒng)由日本奧林帕斯公司生產(chǎn)。

1.4 模型建立及處理

SPF級(jí)TLR4-/-小鼠共70只，雌雄各半，隨機(jī)取12只為正常對(duì)照組，予以普通飼料喂養(yǎng);其余58只予以高脂飼料喂養(yǎng)13周，飼料含脂肪21%，膽固醇0.15%[3]。13周后隨機(jī)抽取5只解剖觀察胸主動(dòng)脈，光鏡下發(fā)現(xiàn)斑塊為造模成功;造模過(guò)程中死亡5只小鼠。造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、護(hù)心康組、阿托伐他汀組、Wnt抑制劑WIF組，每組12只，分別予以相應(yīng)處理。正常組不做處理，其余各組均予灌胃和腹腔注射處理，灌胃容積均為0.5 mL、腹腔注射容積均為0.3 mL，1次/d。模型組予以生理鹽水灌胃并腹腔注射;護(hù)心康組按動(dòng)物與人體間的等效換算法，按生藥劑量21.6 g/kg·d灌胃，腹腔注射生理鹽水;阿托伐他汀組按3 mg/（kg·d）灌胃，腹腔注射生理鹽水;Wnt抑制劑WIF用量為2 ug，生理鹽水稀釋后腹腔注射，生理鹽水灌胃，上述處理時(shí)間均為8周。

1.5 觀察指標(biāo)

于第21周末，3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，進(jìn)行心臟采血，使用酶比色法檢測(cè)血脂，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。然后打開(kāi)小鼠胸廓充分顯露心臟，將主動(dòng)脈分離出來(lái)，取胸主動(dòng)脈固定于4%的多聚甲醛中，取小鼠主動(dòng)脈血管，乙醇脫水及二甲苯透明后石蠟包埋切片，常規(guī)脫臘脫水后進(jìn)行HE染色，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)法測(cè)定β-cateninn，以標(biāo)本出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性顯色;OlympusBX-51光學(xué)顯微鏡400 倍觀察切片，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，每張切片分析5個(gè)連續(xù)的視野， 取其均值為該標(biāo)本測(cè)量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnet檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血脂檢測(cè)

造模后動(dòng)物的血脂水平比正常組明顯升高（P<0.05），其中高密度脂蛋白的升高考慮是機(jī)體受到膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的刺激后產(chǎn)生的應(yīng)激性增高，屬于保護(hù)性;阿托伐他汀和護(hù)心康對(duì)膽固醇和低密度脂蛋白的升高具有明顯的療效（P<0.05），WIF的對(duì)其的降低作用不明顯;三種藥物對(duì)甘油三酯和高密度脂蛋白的影響相對(duì)較小。

2.2 病理學(xué)觀察

造模過(guò)程中小鼠死亡5只。21周后觀察光鏡胸主動(dòng)脈。正常組無(wú)斑塊形成，主動(dòng)脈管壁分層清楚，內(nèi)膜平整光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，平滑肌細(xì)胞走形良好。模型組動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，大量斑塊形成，血管腔明顯減小，表明造模成功。各藥物干預(yù)組亦內(nèi)膜均有不同程度增厚，伴有粥樣斑塊形成，但斑塊病變減輕，斑塊面積變小，泡沫細(xì)胞減少。

2.3 β-catenin蛋白的表達(dá)

細(xì)胞胞漿可見(jiàn)的棕黃色顆粒為β-catenin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，棕黃色顆粒越多，表達(dá)越明顯。高脂造模后，模型組中β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P<0.01）;與模型組相比，三種藥物均能降低β-catenin ，Wnt抑制劑WIF降低作用較強(qiáng)（P<0.01），護(hù)心康組和阿托伐他汀組也有明顯的降低作用（P<0.05）;WIF降低β-catenin的作用較阿托伐他汀強(qiáng)（P<0.05）。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與高血脂有密切關(guān)系，高血脂可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，脂質(zhì)沉積，同時(shí)誘發(fā)單核細(xì)胞浸潤(rùn)血管壁，，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，誘發(fā)慢性血管炎癥，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄。Wnt是由19個(gè)蛋白分子構(gòu)成的分泌蛋白家族，通過(guò)分泌蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活相應(yīng)的基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞粘附和炎癥因子的釋放等生理病理過(guò)程。Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩大類(lèi)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路屬于經(jīng)典型通路，居于Wnt通路中研究之首。Wnt與其受體卷曲蛋白或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白結(jié)合，通過(guò)一系列反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin增多，進(jìn)而與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子發(fā)生相互作用，激活Wnt信號(hào)通路相關(guān)靶基因，從而影響下游炎癥反應(yīng)和細(xì)胞粘附[4]。β-catenin蛋白屬于Wnt /β-catenin 通路的上游因子，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中。研究表明：動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中β-catenin的基因和蛋白表達(dá)明顯升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路參與了AS的形成[5]。激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性增強(qiáng)，使單核細(xì)胞易于和內(nèi)皮粘附，從而誘發(fā)血管壁炎癥[6]。β-catenin也可激活Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的表達(dá)釋放，表明Wnt/β-catenin通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[7]。激活Wnt信號(hào)通路可導(dǎo)致脂代謝紊亂，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，說(shuō)明其與高血脂有密切關(guān)系[8]。以上研究都提示：Wnt信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化形成的多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)，尤其是高血脂和炎癥反應(yīng)有關(guān)，主要作用靶點(diǎn)為內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理基礎(chǔ)是痰濁和瘀血，因此治療中常常貫徹活血化瘀和祛痰消濁。護(hù)心康主要具有消痰散結(jié)和活血行瘀的作用，在臨床冠心病的治療中取得了較好的療效。研究發(fā)現(xiàn)：護(hù)心康對(duì)痰瘀阻絡(luò)型冠心病具有較好的療效，能有效改善心絞痛的發(fā)作癥狀和心電圖表現(xiàn)[9];同時(shí)提高患者的生存質(zhì)量[10]。護(hù)心康可以降低冠心病患者血清超敏C反應(yīng)蛋白和sICAM-1水平[11]，血清超敏C反應(yīng)蛋白是判斷炎癥的靈敏指標(biāo)，其表達(dá)下降可以降低單核細(xì)胞分泌炎癥因子;血清sICAM-1含量降低可以減少炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞黏附，護(hù)心康通過(guò)降低二者的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，延緩冠心病的發(fā)生發(fā)展。

我們前期以兔動(dòng)脈粥樣硬化為模型的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)護(hù)心康能有效降低血脂[12]，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TLR4、TNF-α的表達(dá)[13-14]，并抑制內(nèi)皮細(xì)胞MyD88 和TRAF6基因的表達(dá)[15]，這些作用共同合力可以起到延緩血管壁炎癥的作用。敲除TLR4基因?qū)?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有和影響呢？本實(shí)驗(yàn)研究顯示：高脂飼料喂養(yǎng)的TLR4-/-小鼠，血脂水平明顯升高;光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增厚，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，血管腔狹窄;說(shuō)明單純抑制TLR4并不能杜絕高脂誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，即動(dòng)脈粥樣硬化是由多因素共同作用而成，單一靶點(diǎn)的處理很難起到一錘定音的效果。免疫組化測(cè)定模型組中β-catenin的表達(dá)水平較正常組明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化與Wnt信號(hào)通路存在緊密聯(lián)系。分別采用降血脂藥物阿托伐他汀、Wnt抑制劑WIF及中藥復(fù)方護(hù)心康對(duì)AS模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示三種藥物均能抑制β-catenin，其中Wnt抑制劑組降低β-catenin的作用較阿托伐他汀和護(hù)心康強(qiáng)，其中護(hù)心康和阿伐他汀可以明顯降低血膽固醇和低密度脂蛋白。我們推測(cè)，護(hù)心康可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減弱下游的炎癥反應(yīng)，從而起到抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

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本文編輯：劉欣悅