◎ 陳梅斯，練習(xí)中，鄭麗斯

（江門(mén)市食品檢驗(yàn)所，廣東 江門(mén) 529000）

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器設(shè)備與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（API4000，美國(guó)AB公司）、液相色譜柱（Shim-pack XR-ODS 3.0 mm×75 mm，2.2 μm)、振蕩器（上海南匯橫沔廠）、固相萃取裝置（AB-1110，美國(guó)Abel）、電子天平（JJ-2000B，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）、水浴氮吹儀（WD-12，杭州奧盛儀器有限公司）。

1.1.2 試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純，乙酸乙酯、甲醇為色譜純。

1.2 測(cè)試方法

按照SN/T 1864-2007《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的規(guī)定，本法使用內(nèi)標(biāo)法對(duì)樣品中氯霉素殘留量進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)操作方法如下：稱取5.00 g蜂蜜試樣置于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入0.1 mL氯霉素-D5（10 ng·mL-1）內(nèi)標(biāo)溶液，加15 mL 15%氯化鈉水溶液，加25 mL乙酸乙酯后振蕩提取1 min，離心取上層乙酸乙酯提取液過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱，收集于濃縮瓶中，樣品殘?jiān)性偌尤?0 mL乙酸乙酯重復(fù)上述操作，合并乙酸乙酯提取液在50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用4 mL水溶解濃縮物后過(guò)C18固相萃取柱凈化，再用10 mL水分兩次洗滌濃縮瓶，洗滌液均過(guò)固相萃取柱，經(jīng)淋洗后，最后用6 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮吹儀濃縮近干后加10 mL50%甲醇水溶液溶解，過(guò)濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2 不確定度的評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型

樣品中的氯霉素殘留含量按式（1）計(jì)算：

式（1）中：X-樣品中氯霉素的殘留量，單位為μg·kg-1；c-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的氯霉素溶液濃度，單位為ng·mL-1；V-樣液最終定容體積，單位為mL；m-最終樣液代表的試樣的質(zhì)量，單位為g。

2.2 不確定度的來(lái)源

①本法使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的溶液濃度引入的不確定度主要來(lái)自以下4個(gè)方面：氯毒素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率a及截距b的不確定度、內(nèi)標(biāo)工作液濃度cis的不確定度以及加入樣品中內(nèi)標(biāo)工作液體積Vis的不確定度。因以上不確定度主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人員操作、試劑、損失因子等變動(dòng)性較大的因素，很難精確評(píng)估，因此采用A類(lèi)方法評(píng)定為主，B類(lèi)評(píng)定為輔。②最終定容的體積及溫度對(duì)體積的影響引入的相對(duì)不確定度，采用B類(lèi)方法評(píng)定。③稱量樣品時(shí)天平引入的相對(duì)不確定度，采用B類(lèi)方法評(píng)定。

2.3 不確定度分量的評(píng)定

2.3.1 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的氯霉素溶液濃度的相對(duì)不確定度u(c)

2.3.1.1 氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的不確定度u(y)樣液中氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)直接讀取，與線性回歸無(wú)關(guān)，其不確定度來(lái)源于方法精密度，人員操作、污染因子等所導(dǎo)致的峰面積之比的變動(dòng)性，因此采用A類(lèi)評(píng)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定n個(gè)平行樣品，得到n個(gè)儀器響應(yīng)值。對(duì)這n次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)運(yùn)算，其標(biāo)準(zhǔn)偏差s(y)作為不確定度u(y)。本實(shí)驗(yàn)在相同條件下，連續(xù)測(cè)定10個(gè)樣品，10次測(cè)定峰面積比的平均值A(chǔ)=0.448，根據(jù)公式計(jì)算得氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的不確定度u(y)：

2.3.1.2 斜率a及截距b的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(a)、u(b)

上述的數(shù)學(xué)模型是在假設(shè)回歸方程為y=ax+b的前提下建立的。斜率和截距的不確定度主要包括由每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的不確定度和實(shí)驗(yàn)點(diǎn)相對(duì)最佳擬合直線的分散性所引起的不確定度。按照標(biāo)準(zhǔn)配制氯霉素濃度為0.05、0.1、0.4、0.8 ng·mL-1和 1.2 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為0.1 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)平行測(cè)定3次：由標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的測(cè)定數(shù)值計(jì)算可得擬合方程為y=0.611 2x+0.002 2（r=0.999 9）。

按式

計(jì)算得s(y)=0.00162

公式中：yji-儀器上所得氯霉素與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，yi-對(duì)應(yīng)濃度的回歸方和計(jì)算值，m-標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的數(shù)目，n-重復(fù)測(cè)定的次數(shù)。

2.3.1.3 內(nèi)標(biāo)工作液濃度cis的不確定度u(cis)

由于內(nèi)標(biāo)是100 μg·mL-1濃度的D5氯霉素儲(chǔ)備液，因此內(nèi)標(biāo)工作液的不確定度由兩部分構(gòu)成，內(nèi)標(biāo)定值引入的不確定度和由內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制工作液引入的不確定度。

（1）內(nèi)標(biāo)定值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(is)。證書(shū)給定的定值最大允差為±1%，按照均勻分布，

（2）配制內(nèi)標(biāo)工作液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(is)2。內(nèi)標(biāo)工作液按如下步驟配制：移取1.00 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶，定容后配成20 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)中間液，然后再移取0.25 mL內(nèi)標(biāo)中間液定容至50 mL配成10 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液。

①由1.00 mL移液管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(1.00)

A級(jí)1.00 mL單標(biāo)移液管允差為±0.005 mL，按均勻分布，

②由50 mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(50)

50 mL A級(jí)單標(biāo)線容量瓶的最大容量允差為±0.05 mL，按均勻分布，

由容量瓶校準(zhǔn)溫度與使用溫度差別引入的不確定度分量u(50)2，20 ℃時(shí)水的體積膨脹系數(shù)α為2.1×10-3℃-1，校正溫度為20 ℃，而本次實(shí)驗(yàn)是在恒溫25 ℃條件下進(jìn)行的，取均勻分布k=，則

合成50 mL容量瓶引入的不確定度：

③由0.50 mL分度吸量管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(0.50)

0.50 mL A級(jí)分度吸量管的最大允差為±0.005mL，按均勻分布，

④因?yàn)樵谂渲七^(guò)程中使用2次50 mL容量瓶，因此配制內(nèi)標(biāo)工作液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(is)2

合成內(nèi)標(biāo)工作液濃度cis的不確定度u(cis)，

2.3.1.4 加入樣品中內(nèi)標(biāo)工作液濃度Vis的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Vis)

樣品中加入內(nèi)標(biāo)工作液的體積Vis為0.10 mL，0.5 mL多標(biāo)移液管的最大允差為±0.005 mL，按均勻分布k=，計(jì)算得：

2.3.1.5 合成不確定度u(c)

2.3.2 最終定容體積引入的相對(duì)不確定度u(V)

樣品經(jīng)萃取、凈化和氮吹濃縮近干后，用5.00 mL單標(biāo)移液管移取50%甲醇水溶液溶解后過(guò)濾膜上機(jī)測(cè)試。5 mL單標(biāo)移液管的B級(jí)容量允差為0.020 mL，按均勻分布k=，計(jì)算得：

2.3.3 稱量樣品（m）引入的相對(duì)不確定度u(m)

采用百分之一分析天平稱量樣品5.00 g，由檢定證書(shū)給出其分度值為0.01 g，取均勻分布k=，則

2.3.4 合成不確定度u(X)及擴(kuò)展不確定度u

樣品中氯霉素殘留量面積比的平均值A(chǔ)=0.448，按擬合方程y=0.6112x+0.0022計(jì)算得

取置信水平為95%，包含因子k=2，則

u=2×u(X)×X=0.025 1 μg·kg-1

修約為 u=0.025μg·kg-1

則蜂蜜中氯霉素殘留量的測(cè)定結(jié)果為（0.729±0.025） μg·kg-1。

3 結(jié)論

在蜂蜜中氯霉素殘留量測(cè)定中不確定度來(lái)源的評(píng)定中，對(duì)該過(guò)程中部分不確定度的來(lái)源進(jìn)行了合理忽略，主要氯毒素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率a及截距b的不確定度、內(nèi)標(biāo)工作液濃度cis的不確定度以及加入樣品中內(nèi)標(biāo)工作液體積Vis的不確定度、最終定容體積的不確定度以及稱取樣品引入的不確定度等7個(gè)方面對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了不確定度評(píng)定。從統(tǒng)計(jì)數(shù)值分析，不確定度的主要來(lái)源氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的不確定度和內(nèi)標(biāo)濃度的不確定度，應(yīng)采取適當(dāng)措施，盡可能減少由此引入的不確定度。