熊 莉， 呂夢娟， 竇德宇， 馬玉紅△

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院診斷教研室， 2. 中心實(shí)驗(yàn)室， 蕪湖 241001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy， DN) 是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。針對DN的研究已逐步成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。研究表明，腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS) 尤其是血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ) 在DN的發(fā)生發(fā)展中有著極其重要的地位[1]。血管緊張素Ⅱ是RAS的主要活性物質(zhì)，它不僅作為一種血管活性物質(zhì)參與RAS的活化效應(yīng)過程，局部產(chǎn)生的過量AngⅡ還能作為一種重要的生長因子參與細(xì)胞生長、纖維化、免疫調(diào)節(jié)等過程，引起腎臟損傷[2, 3]，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。黃芪甲苷(astragaloside-IV，As-IV)是傳統(tǒng)中藥黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一?，F(xiàn)代研究表明As-IV具有抗衰老、抗炎抗病毒、抗氧化的藥理作用[4]。本研究選用Ang II刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，GMCs)模擬腎損傷細(xì)胞模型，通過觀察不同劑量As-IV對Ang II介導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖及炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響，從細(xì)胞水平研究As-IV抑制GMCs炎癥因子表達(dá)的可能機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識和評價As-IV治療腎臟疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GMCs株由皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈。

1.2 試劑

As-IV，上海源葉生物科技有限公司；AngⅡ，北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國Sigma公司；低糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司；DCFH-DA熒光探針，美國Sigma公司；MCP-1 ELISA檢測試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；TGF-β1一抗，美國CST公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將冷凍于液氮罐中的細(xì)胞株取出按常規(guī)方法復(fù)蘇后，接種于完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基)的培養(yǎng)瓶中。置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%，進(jìn)行消化傳代。取5～7代對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 血管緊張素Ⅱ最佳濃度的篩選

1.5 As-IV給藥方法與劑量設(shè)置

將As-IV用DMSO助溶后用低糖DMEM培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度與AngⅡ共孵育給藥，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為5組：正常對照組、AngⅡ(10-6mol/L)組、AngⅡ(10-6mol/L)+As-IV(25 μmol/L)組、AngⅡ(10-6mol/L)+As-IV(50 μmol/L)組、AngⅡ(10-6mol/L)+As-IV(100 μmol/L)組。MTT實(shí)驗(yàn)設(shè)6個復(fù)孔，ELISA實(shí)驗(yàn)設(shè)5個復(fù)孔，流式細(xì)胞術(shù)及Western blot實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔板上，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至80～90%，換無血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h使其同步化，隨機(jī)分為5組(分組如下)：每組設(shè)立6個復(fù)孔。置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。吸盡各孔上清液，每孔加入150 μl DMSO，溶解振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度(optical density, OD)值。細(xì)胞增殖率= ( 處理組A490/對照組A490) × 100 %。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板上，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h ，待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)，換用無血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h使其同步化，隨機(jī)分為5組(分組同1.5)：每組設(shè)立3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，吸盡各孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入含10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)液1 ml，置于37℃避光孵育20 min，用PBS 緩沖液洗3 次，再用不含EDTA的0. 25%胰酶進(jìn)行消化，最后用含3%胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。采用Flowjo7.6軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算DCF平均熒光強(qiáng)度。

1.8 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中MCP-1含量

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板上，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h ，待細(xì)胞生長至80～90%，換用無血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h使其同步化。細(xì)胞分組培養(yǎng)同“1.5”，每組設(shè)5個復(fù)孔。48 h后，收集各孔內(nèi)細(xì)胞上清液，離心后待測。操作步驟按照ELISA試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行。

1.9 Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白的表達(dá)

細(xì)胞分組培養(yǎng)同“1.5”，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入裂解液，裂解完畢后離心，收集上清液。采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到NC膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。羊抗兔TGF-β1多克隆抗體4℃下孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑顯影成像，用Image J軟件對灰度值進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血管緊張素Ⅱ最佳濃度的篩選

各組細(xì)胞經(jīng)AngⅡ孵育24 h后，可見隨著AngⅡ刺激濃度的不斷增加，刺激組的OD值明顯上升，表明AngⅡ刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生增殖，并且在AngⅡ10-6mol/L濃度時，細(xì)胞增殖最顯著(P<0.05)，因此10-6mol/L是本實(shí)驗(yàn)中AngⅡ刺激細(xì)胞的最佳作用濃度(圖1)。

OD： Optical density; GMCs: Glomerular mesangial cells

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.2 As-IV對AngⅡ誘導(dǎo)GMC細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，與正常組相比，AngⅡ模型組細(xì)胞OD值明顯上升(P<0.01)，表明其顯著增殖；與AngⅡ模型組相比，AngⅡ+As-IV高、中、低劑量組細(xì)胞OD值明顯下降，其中，高劑量(100 μmol/L) 組對AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的抑制作用最顯著(P<0.01)，表明As-IV組可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖，且存在濃度依賴性(P<0.05, 表1)。

Group DoseODControl -0.563±0.031Model 10-6 mol/L0.824±0.036??As-IV25 μmol/L0.753±0.023#As-IV50 μmol/L0.659±0.027##As-IV100 μmol/L0.597±0.022##

**P<0.01vscontrol:#P<0.05，##P<0.01vsmodel

2.3 As-IV對AngⅡ誘導(dǎo)GMC細(xì)胞中ROS含量的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示；與正常組相比，AngⅡ模型組細(xì)胞內(nèi) ROS 生成量顯著增多(7.6±0.8vs45.3±2.6，P<0.01)；與AngⅡ模型組相比，AngⅡ+As-IV高中低劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯減少，并呈一定的劑量依賴性(P<0.05)，分別為低劑量組(36.9±2.3)、中劑量組(26.4±1.7)、高劑量組 (17.6±1.8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.4 As-IV對AngⅡ誘導(dǎo)GMCs細(xì)胞中MCP-1分泌的影響

ELISA結(jié)果顯示，正常條件下，腎小球系膜細(xì)胞上清液中有少量MCP-1的表達(dá)，AngⅡ刺激細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中MCP-1分泌顯著增加，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與AngⅡ模型組相比，AngⅡ+As-IV高、中、低劑量組細(xì)胞上清液中MCP-1表達(dá)量顯著下降(P<0.05，P<0.01)，其中高劑量(100 μmol /L) 組作用最顯著(P<0.01)，可將MCP-1分泌量由(196.25±16.52)pg/ml降低到(102.91±11.28)pg/ml，表明一定濃度As-IV(25～100)μmol/L可呈劑量依賴性抑制AngⅡ誘導(dǎo)GMC細(xì)胞上清液中MCP-1的表達(dá)(P<0.05, 表2)。

Fig.2Effects of As-IV on intercellular ROS levels of glomerular cells induced by AngⅡ

MFI: Mean fluorescence intensity; ROS: Reactive oxidative species

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Group DoseMCP-1Control -85.63±11.72Model10-6 mol/L196.25±16.52#As-IV25 μmol/L166.67±12.61?As-IV50 μmol/L131.91±11.45??As-IV100 μmol/L 102.91±11.28??

MCP-1: Monocyte chemoattractant protein-1

**P<0.01vscontrol:#P<0.05，##P<0.01vsmodel

2.5 As-IV對AngⅡ誘導(dǎo)GMC細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Western blot 免疫印跡法結(jié)果顯示，與正常組相比，AngⅡ模型組細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.01)。與AngⅡ模型組相比，AngⅡ+As-IV高、中、低劑量組細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白的表達(dá)均有不同程度的降低(P<0.05，P<0.01)，其中高劑量(100 μmol /L) 組作用最顯著(P<0.01)，可將TGF-β1蛋白與內(nèi)參灰度值相對比值從AngⅡ模型組的0.789±0.018降至0.068±0.016，表明一定濃度的As-IV(25～100 μmol/L)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)GMC細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白的表達(dá)(圖3)。

Fig.3Effects of As-IV on TGF-β1 protein expression of glomerular cells induced by AngⅡ

TGF-β1 : Transforming growth factor-β1

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

3 討論

DN病變過程中系膜細(xì)胞增殖具有重要的病理作用。近年來局部RAS活化被認(rèn)為是DN病情進(jìn)展的主要機(jī)制之一[5]。本實(shí)驗(yàn)用AngⅡ刺激GMCs模擬DN體外模型，結(jié)果顯示AngⅡ可以有效刺激GMCs細(xì)胞增殖。已知AngⅡ是RAS中一種重要的生物活性肽，它不僅作為一種血管活性物質(zhì)參與RAS的活化效應(yīng)過程，局部產(chǎn)生的AngⅡ還能作為一種重要的生長因子參與細(xì)胞生長、纖維化、免疫調(diào)節(jié)等過程。為確定AngⅡ最佳作用濃度，本研究利用濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定了AngⅡ造模的最佳濃度為10-6mmol /L。AngⅡ在發(fā)揮生理作用之前先與細(xì)胞表面特定的受體結(jié)合，AngⅡ的作用主要通過血管緊張素受體1(AT1)受體所介導(dǎo)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)作用，如ROS，促發(fā)炎癥因子分泌等。AngⅡ與AT1受體結(jié)合后可產(chǎn)生ROS[6]，ROS作為極其重要的細(xì)胞內(nèi)信使，在正常腎臟中會少量產(chǎn)生。當(dāng)受到AngⅡ、高糖等一系列因素刺激后，ROS過量產(chǎn)生，進(jìn)而打破腎臟氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡[7]，過量的ROS是引起糖尿病腎損傷多條通路激活的共同途徑[8]，在ROS生成酶豐富的腎臟細(xì)胞中，ROS可作為細(xì)胞內(nèi)信使，激活多種氧化還原敏感性信號通路，引發(fā)腎臟細(xì)胞損傷。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量，發(fā)現(xiàn)正常情況下GMCs細(xì)胞中表達(dá)少量的ROS，當(dāng)AngⅡ刺激細(xì)胞24 h后，ROS生成量明顯增多，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。這與Zhang F等研究結(jié)果相一致[9]。

單核細(xì)胞趨化蛋白1( monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是CC趨化因子家族中的一種炎性趨化因子。病理狀態(tài)下MCP-l 過度表達(dá)，不僅引發(fā)單核-巨噬細(xì)胞聚集活化，還可通過自分泌或旁分泌的形式直接刺激腎臟細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子[10]，如TGF-β1、IL-1、結(jié)締組織生長因子等，其中，TGF-β1在體內(nèi)的主要生物學(xué)效應(yīng)是通過自分泌和旁分泌直接促進(jìn)系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞肥大，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌與積累，參與腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化等病理過程，加重腎損傷，最終引發(fā)終末期腎衰[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下GMCs細(xì)胞中表達(dá)少量的MCP-1及TGF-β1，當(dāng)AngⅡ刺激細(xì)胞24 h后，MCP-1及TGF-β1分泌量明顯增多。與文獻(xiàn)報道一致。表明AngⅡ能刺激腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，引發(fā)和加重腎損傷。

目前，臨床上應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)聯(lián)合AngⅡ受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ receptor antagonist, ARB)治療糖尿病腎病，如貝那普利、纈沙坦等，具有良好的治療效果，但少數(shù)病人出現(xiàn)的不良反應(yīng)仍不容忽視。中藥具有多靶點(diǎn)、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。黃芪(Astragalus membranaceus)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效。對心血管系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病均有一定療效[12]。As-IV是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，是黃芪發(fā)揮作用的有效成分群。本研究觀察不同濃度的黃芪甲苷對AngⅡ誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)的影響，結(jié)果表明，黃芪甲苷能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖、ROS水平、MCP-1及TGF-β1的表達(dá)，提示黃芪甲苷可能通過緩解氧化應(yīng)激從而減輕腎小球的炎性反應(yīng)，這可能是黃芪甲苷保護(hù)腎臟的重要機(jī)制之一, 為進(jìn)一步認(rèn)識和評價As-IV治療腎臟疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。