陳信信， 張曉蕓， 丁玉真， 李 鑫， 官秀梅， 李 宏， 成 敏△， 崔曉棟△

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 2. 臨床醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)存在于肝血竇Disse間隙內(nèi)皮屏障下，亦稱貯脂細(xì)胞，HSCs也具有調(diào)節(jié)肝血竇血流的作用。當(dāng)肝細(xì)胞受到某些致病因素作用發(fā)生損傷時(shí)，HSCs可被大量激活，轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，從而合成大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積在肝臟內(nèi)，造成肝內(nèi)血管重塑及血流異常，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化。故認(rèn)為激活的HSCs是促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程的重要因素[1]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在出生后血管形成中發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量和頻次的EPCs移植可顯著改善肝纖維化的發(fā)生[2,3]，故EPCs對(duì)防治肝纖維化有潛在的應(yīng)用前景。但EPCs在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的具體作用和機(jī)制尚不清楚。

研究顯示，HSCs和EPCs均定位于肝臟肝血竇Disse間隙內(nèi)，此間隙被稱作二者的生態(tài)小境(ecological niche)。生態(tài)小境中的HSCs和EPCs勢(shì)必相互影響。不容忽視的是，肝臟血液動(dòng)力學(xué)改變?cè)斐傻牧黧w切應(yīng)力的變化亦影響著生態(tài)小境中各類細(xì)胞的功能狀態(tài)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一定的剪切應(yīng)力可促進(jìn)EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，加速動(dòng)脈血管損傷部位的修復(fù)[4]。因此，在流體力學(xué)環(huán)境下的EPCs所形成的生態(tài)小境對(duì)HSCs的生物學(xué)特性極有可能產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而改變HSCs的細(xì)胞功能。本實(shí)驗(yàn)利用生物力學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的方法和技術(shù)，在EPCs和HSCs共培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，對(duì)EPCs行剪切應(yīng)力處理，探究力學(xué)環(huán)境下的EPCs對(duì)HSCs生物學(xué)功能的影響，從而揭示EPCs治療肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

SD大鼠(200～250) g，雌雄不限，解放軍第89醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供；熒光定量PCR(Bio-Rad IQ5)；5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，Millicell共同培養(yǎng)小室(Millipore)；Histopaque-1083(Sigma)；DMEM高糖(Gibco公司)；EGM-2完全培養(yǎng)基(Lonza)；胎牛血清(FBS，Hyclone)；纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N, Roche)；Trizol試劑(Invitrogen)；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物)；0.25%胰蛋白酶液(Hyclone)；CCK-8試劑盒(同仁，日本)； SYBR Prime Script? RT-PCR Kit II及相關(guān)引物設(shè)計(jì)(大連寶生物公司)；抗α-SMA、抗Col-I、抗Col-III抗體(博奧森生物技術(shù)公司)。

1.2 EPCs的分離與培養(yǎng)

采用Histopaque-1083密度梯度離心法分離成年大鼠股骨和脛骨骨髓腔的單個(gè)核細(xì)胞，而后用EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)，具體操作步驟及EPCs鑒定方法參照課題組前期文獻(xiàn)進(jìn)行[5,6]。本實(shí)驗(yàn)采用3～4代EPCs作為研究對(duì)象。

1.3 HSC-T6的培養(yǎng)

將HSC-T6(上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授惠贈(zèng))接種于含10% FBS的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到90%時(shí)傳代培養(yǎng)，以3～6代用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 HSCs與EPCs共培養(yǎng)模型

具體方法按參考文獻(xiàn)[7, 8]進(jìn)行。即第1日將共培養(yǎng)小室(膜孔徑為0.4 μm)倒置，下層用纖維連接蛋白(FN)打底，將3～4代EPCs(1×105個(gè))接種于小室底膜上，待細(xì)胞貼壁后置于6孔板中，用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。第2日將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HSCs(1×105個(gè))置于小室上層膜中，培養(yǎng)24 h。

1.5 構(gòu)建剪切應(yīng)力加載系統(tǒng)

剪切應(yīng)力加載系統(tǒng)由流槽瓶、管道、平板流室、蠕動(dòng)泵等組成(圖1)。將共培養(yǎng)模型小心加至平板流室的共培養(yǎng)小室支架上，蓋好流槽蓋，通過剪切應(yīng)力加載系統(tǒng)施加剪切應(yīng)力，本實(shí)驗(yàn)采用12 dyne/cm2加載實(shí)驗(yàn)。除蠕動(dòng)泵外，整套系統(tǒng)置于CO2培養(yǎng)箱中。

Fig.1Sketch of co-culture model, flow chamber and shear stress loading system

1.6 分組

以EPCs和HSCs共培養(yǎng)靜止組為對(duì)照組，12 dyne/cm2的剪切應(yīng)力加載于EPCs與HSCs共培養(yǎng)模型的為實(shí)驗(yàn)組。

1.7 HSCs的增殖檢測(cè)

用0.25 %胰酶液消化細(xì)胞(3～6代)，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為5×104cells/ml，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，每組9個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱孵育1 h，在酶標(biāo)儀下測(cè)A450nm處的吸光度值。

1.8 HSCs細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

將0.25%胰酶液消化的細(xì)胞置EP管中離心，收集1～5×105個(gè)細(xì)胞，取300～500 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕柔混勻后，室溫避光孵育15 min，上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 HSCs的粘附檢測(cè)

用FN給24孔板打底1 h，用0.25 %胰酶液消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104cells/ml，每孔加1 ml細(xì)胞懸液于24孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育30 min。用PBS輕輕洗去未貼壁細(xì)胞，鏡下隨機(jī)拍照，每孔選取6～9個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞取平均值。

1.10 HSCs的遷移檢測(cè)

0.25%胰酶液消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104cells/ml，將Boyden小室下腔加滿培養(yǎng)基，蓋上濾膜，加上膜腔，中間擰緊，上腔中垂直加入200 μl細(xì)胞懸液，每組3個(gè)復(fù)孔，加蓋玻片封口，置CO2培養(yǎng)箱中孵育8 h。取出，用棉簽輕輕拭去濾膜上方細(xì)胞，取下濾膜反面放入12孔板中，PBS清洗，切勿振蕩，4%多聚甲醛液室溫固定15 min，再次用PBS清洗3遍，DAPI熒光染色，熒光顯微鏡下拍照，每張膜選取3～5個(gè)視野(×200)，計(jì)數(shù)細(xì)胞作統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 提取細(xì)胞總RNA、熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，用DEPC處理的去離子水溶解并保存在-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)寶生物說明書操作熒光定量RT-PCR，寶生物公司設(shè)計(jì)合成反應(yīng)引物，具體信息見表1。構(gòu)建反應(yīng)體系后，按設(shè)定程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，根據(jù)CT值，按公式 2-ΔCt(ΔCt) = Ct (target) Ct (GAPDH) 計(jì)算出各組擴(kuò)增效率。

Tab. 1 Sequence information of primers

1.12 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

收集消化所得細(xì)胞，按比例加入裂解液在冰上充分裂解細(xì)胞，加入SDS上樣緩沖液稀釋，煮沸5 min，6 000 r/min離心3 min，取上清上樣。以12 %(w/v)膠濃度作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉1 h，加入兔抗鼠多克隆一抗，4 ℃孵育過夜, 再與HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋) 室溫下?lián)u育1 h，用ECL發(fā)光顯色系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)條帶，成像系統(tǒng)成像。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 剪切應(yīng)力作用下EPCs生態(tài)小境對(duì)HSCs增殖、粘附和遷移能力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：剪切應(yīng)力組HSCs增殖(A450nm值)明顯低于對(duì)照組(表2)；粘附能力亦明顯低于對(duì)照組(圖2A、表2)；施加剪切應(yīng)力后，EPCs生態(tài)小境對(duì)HSCs的遷移能力有明顯抑制作用(圖2B、表2)。

Fig.2Effect of EPCs? ecological niche on adhesion (A， uncolored ×200) and migration (B， DAPI staining ×200) of HSCs under shear stress

GroupProliferationAdhesionMigrationControl1.091±0.320109.7±4.317.2±1.5Shear stress0.565±0.054??36.0±3.2??8.0±1.4??

**P<0.01vscontrol

2.2 剪切應(yīng)力下EPCs生態(tài)小境對(duì)HSCs細(xì)胞中α-SMA、Col-I、Col-III mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

共培養(yǎng)組經(jīng)剪切應(yīng)力處理后，HSCs α-SMA基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05，表3)。結(jié)果提示，剪切應(yīng)力作用下的EPCs對(duì)HSCs無明顯激活作用。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Col-I 和Col-III的mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著降低，且Col-I/Col-III相對(duì)比值降低(P<0.05，P<0.01， 表3，圖3)，提示剪切應(yīng)力作用下EPCs可能通過影響HSCs的膠原分泌對(duì)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定影響。

GroupmRNA expressionProtein expressionα-SMA0.73±0.200.911±0.01Col-I0.49±0.18?0.42±0.03??Col-III0.50±0.27?0.70±0.07?Col-I/Col-III —0.60±0.06??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig.3Effect of EPCs ecological niche on protein expression of α-SMA, Col-I and Col-III in HSCs under shear stress

2.3 剪切應(yīng)力下EPCs生態(tài)小境對(duì)HSCs 凋亡的影響

剪切應(yīng)力作用12 h后，實(shí)驗(yàn)組HSCs細(xì)胞凋亡率為(39.16±3.02)%，明顯高于對(duì)照組的(17.31±2.23)%(圖4)，提示剪切應(yīng)力作用下，EPCs生態(tài)小境可促進(jìn)HSCs凋亡的發(fā)生。

3 討論

目前認(rèn)為，HSCs大量活化是造成肝纖維的主要原因[9]。活化后的HSCs可轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而大量增殖，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，包括Col-I、Col-III、透明質(zhì)酸等,造成細(xì)胞外基質(zhì)或纖維成分過多，有可能導(dǎo)致假小葉的形成，進(jìn)而發(fā)展為肝纖維化、肝硬化[9]?，F(xiàn)階段對(duì)肝纖維化和肝硬化的治療手段非常有限。近年來文獻(xiàn)證實(shí)，外源或自身來源的EPCs移植能夠促進(jìn)肝內(nèi)血管新生，對(duì)肝纖維化有顯著的治療作用[2,3]，但具體機(jī)制尚不清晰。

劉峰等體外研究顯示，HSCs與EPCs可能存在一定的交互關(guān)系，進(jìn)而提示二者的相互作用可能影響肝纖維化進(jìn)程的發(fā)生和發(fā)展[10]。我們前期研究顯示，EPCs易受流體力學(xué)影響而改變其生物學(xué)特性，如前所述，歸巢后的EPCs在肝血竇內(nèi)極易受到流體力學(xué)的影響，故在流體力學(xué)作用下的EPCs所形成的生態(tài)小境極有可能對(duì)HSCs的生物學(xué)特性產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而改變HSCs的功能。因此，我們建立剪切應(yīng)力環(huán)境下EPCs與HSCs體外共培養(yǎng)模型，對(duì)EPCs施加12 dyne/cm2剪切應(yīng)力，研究在剪切應(yīng)力作用下EPCs導(dǎo)致生態(tài)小境改變對(duì)HSCs生物學(xué)性能產(chǎn)生的影響。與單純靜止共培養(yǎng)的對(duì)照組相比，HSCs的增殖、粘附和遷移能力均明顯下降(P<0.01)，而增殖、遷移和粘附是HSCs的重要的生物學(xué)行為，也是抗肝纖維化研究的切入點(diǎn)。該結(jié)果提示，在剪切應(yīng)力作用下的EPCs對(duì)HSCs的生物學(xué)行為起到更明顯的抑制效應(yīng)。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示，剪切應(yīng)力作用下的EPCs對(duì)HSCs無明顯激活作用，究其原因可能有二：(1)實(shí)驗(yàn)選擇HSC-T6為研究細(xì)胞，而HSC-T6已是活化后的HSCs細(xì)胞株，故EPCs對(duì)HSCs無明顯激活作用；(2)EPCs可能通過調(diào)節(jié)HSCs的其他生物學(xué)功能而發(fā)揮作用。后續(xù)結(jié)果顯示：在剪切應(yīng)力環(huán)境下的EPCs能明顯抑制HSCs的粘附、遷移，顯著抑制HSCs增殖并促進(jìn)其凋亡，提示EPCs很可能通過影響HSCs的生物活性，抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

正常肝臟的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)約占肝臟總蛋白的5%～10%，活化的HSCs可產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，是肝纖維化時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源細(xì)胞。慢性肝臟損傷是以Col-I、Col-III含量改變，尤其是Col-I比例增加為主要特點(diǎn)[11]。據(jù)此，本文研究了剪切應(yīng)力環(huán)境下的EPCs對(duì)HSCs生成Col-I、Col-III的影響。結(jié)果顯示，與靜止共培養(yǎng)組相比，在剪切應(yīng)力作用下，EPCs抑制了HSCs Col-I、Col-III的表達(dá)，Col-I/Col-III相對(duì)比值減小，提示在剪切應(yīng)力環(huán)境下EPCs可更好地抑制細(xì)胞外基質(zhì)的生成。

綜上，本研究從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)角度，探討了剪切應(yīng)力作用下的EPCs對(duì)HSCs生物學(xué)特性的影響，該研究對(duì)揭示EPCs治療肝纖維化的機(jī)理有重要提示和意義。本實(shí)驗(yàn)僅初步探索了力學(xué)環(huán)境下的EPCs對(duì)HSCs細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，有關(guān)二者間的相互作用、細(xì)胞交流機(jī)制等尚需深入研究。