崔桂玉， 白 劍， 苗蘭英， 林大勇， 劉 鴻， 李亞麗， 劉喜成△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 通遼 028000； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 沈陽(yáng) 110847；3. 深圳市人民醫(yī)院麻醉科， 廣東 深圳 518020； 4. 深圳市麻醉醫(yī)學(xué)工程研究中心， 廣東 深圳 518020)

器官移植是治療器官功能衰竭的有效手段之一，但是排斥反應(yīng)是制約移植物長(zhǎng)期存活的主要障礙。有研究顯示，器官移植受者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte, Treg)的出現(xiàn)則表明移植物在受者體內(nèi)產(chǎn)生了免疫耐受，預(yù)示著患者術(shù)后恢復(fù)良好，與對(duì)增加移植物的存活時(shí)間、減少排斥反應(yīng)的發(fā)生有著重要意義[1-2]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，由于其具有低免疫原性、來(lái)源廣泛和免疫抑制的特點(diǎn)，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療和預(yù)防移植物抗宿主病[3]。但是，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)雖然十分明確，但是作用效果不強(qiáng)，因此許多研究通過(guò)轉(zhuǎn)染CTLA4、IDO和IL-10等基因來(lái)增加間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能[4-6]。人類白細(xì)胞抗原-G(Human Leukocyte Antigen, HLA-G)屬于非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，在孕婦體內(nèi)表達(dá)較高，其主要功能是誘導(dǎo)母嬰耐受，具有明確的免疫抑制作用。有研究顯示HLA-G可以誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，并且促進(jìn)體內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞分泌IL-10誘導(dǎo)免疫耐受的形成[7]。因此，本研究在此基礎(chǔ)上將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞外源性的轉(zhuǎn)染HLA-G基因，通過(guò)將HLA-G陽(yáng)性的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞混合體外培養(yǎng)，檢測(cè)HLA-G陽(yáng)性的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/DF12培養(yǎng)基、PBS(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CX31倒置顯微鏡(Olympus)；BD FACSCalibur(BD公司)；Percoll分離液(GE公司)；單克隆抗體CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC/CD4-FITC/CD25-PE/Foxp3-APC(BD公司)；PEGFP-N1-HLA-G全基因合成質(zhì)粒(北京奧科鼎盛生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；HLA-G特異性單抗4H84和α-Tublin(Santa Cruz公司)；CD4+分選試劑盒(Miltenyi公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)； 0.25%胰酶(Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)所用分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)北京分公司。

足月新生兒胎盤取自于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，取得父母知情同意書后，經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論通過(guò)用以制備胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

用75%酒精消毒胎盤表面后，用生理鹽水反復(fù)沖洗3次。在超凈工作臺(tái)中，用眼科剪刀將胎盤剪成約1～2 mm3大小的碎塊，放入50 ml離心管中，用生理鹽水沖洗后1 500 r/min離心5 min，。后棄去上清液，使用生理鹽水重復(fù)上述步驟1次，加入含 0.25%胰酶和0.1%膠原酶Ⅳ的生理鹽水30 ml，置37℃培養(yǎng)箱中30 min，使酶能充分發(fā)揮活性。用100目的濾網(wǎng)過(guò)濾胎盤碎塊，用15 ml離心管收集濾液，1 500 r/min離心5 min棄去上清液，在細(xì)胞沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基，充分混勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度90%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化，將細(xì)胞按1∶3接種于新的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)傳代細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1×106cells/ml。取200 μl細(xì)胞懸液，分別加入CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC流式抗體各5 μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，避光室溫孵育20 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45、CD34、HLA-DR、CD29、CD44和CD105的表達(dá)情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)轉(zhuǎn)染情況不同，將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組為未經(jīng)轉(zhuǎn)染的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；PEGFP-N1組為轉(zhuǎn)染PEGFP-N1質(zhì)粒載體的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；PEGFP-N1-HLA-G組為轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HLA-G質(zhì)粒的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定后，分別與T淋巴細(xì)胞一起作混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，并檢測(cè)各組中的Treg含量。

1.4 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染HLA-G基因及鑒定

將指數(shù)生長(zhǎng)期的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞2×105個(gè)接種到6孔板內(nèi)，加入含10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基3ml，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到約80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別取LipofectamineTM2000試劑1.5 μl與PEGFP-N1-HLA-G或空載體PEGFP-N1各0.5 μg用DMEM/F12稀釋到200 μl，將混合后的LipofectamineTM2000室溫放置30 min。棄去6孔板內(nèi)含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基并用PBS沖洗細(xì)胞2次，每孔中加入1 000 μl無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，再將200 μl混有PEGFP-N1-HLA-G或空載體PEGFP-N1的LipofectamineTM2000的DMEM/F12分別滴入6孔板內(nèi)，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入含10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基3 ml，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

收集6孔板中轉(zhuǎn)染后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)蛋白裂解液裂解后，收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心1 min，棄上清備用。BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，在SDS-PAG板上樣，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。滴加5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜。滴加抗HLA-G(1∶1 000稀釋)和抗α-tublin(1∶1 000稀釋)抗體，4℃孵育過(guò)夜后，再滴加二抗37℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)各條帶的吸光度值，計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 健康人外周血中CD4+的T淋巴細(xì)胞的分離

在50 ml離心管中加入健康人末梢血10 ml，同時(shí)加入等體積的Percoll分離液，1 500 r/min離心20 min，吸取液面交界處的有核細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，使用PBS稀釋后1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再加入10 ml PBS重復(fù)離心清洗一次。加入PBS稀釋沉淀，并調(diào)整有核細(xì)胞懸液密度為1×107cells/ml。取150 μl細(xì)胞懸液，加入40 μl CD4 MicroBeads混勻，置培養(yǎng)箱中孵育10 min。將LS柱放置于MACS分選架上，用緩沖液沖洗，將孵育好的細(xì)胞懸液導(dǎo)入LS柱中，用3 ml緩沖液沖洗一次。CD4+細(xì)胞滯留于LS柱中，用緩沖液將LS柱中吸附的CD4+細(xì)胞洗脫下來(lái)，并用15 ml離心管離心備用。

1.6 各組胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞一起作混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

將分離的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)1∶10的比例加入到含HLA-G陽(yáng)性的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的6孔板內(nèi)，同時(shí)按照相同的比例將CD4+T淋巴細(xì)胞加至空載體組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的6孔板內(nèi)，并在上述各組中加入含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h和48 h后，檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg占T淋巴細(xì)胞的比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子的鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)第二代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記物，CD45、CD34和HLA-DR呈陰性表達(dá)，CD29、CD44和CD105呈陽(yáng)性表達(dá)。其中，CD29陽(yáng)性表達(dá)率為98.1%，CD44陽(yáng)性表達(dá)率為99.3%，CD105陽(yáng)性表達(dá)率為98.9% (圖1)

2.2 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染HLA-G基因的鑒定

空白對(duì)照組中HLA-G蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量為PEGFP-N1-HLA-G組的(0.23±0.05)倍，空白對(duì)照組與PEGFP-N1-HLA-G組比較，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PEGFP-N1組中HLA-G蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量為PEGFP-N1-HLA-G組的(0.27±0.03)倍，PEGFP-N1組與PEGFP-N1-HLA-G組相比，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2，表1)。

2.3 HLA-G陽(yáng)性胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生

空白對(duì)照組、PEGFP-N1組和PEGFP-N1-HLA-G組肽盤間充質(zhì)干細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，各組Treg細(xì)胞占全部T淋巴細(xì)胞的比例分別為(11.56±0.52)%、(10.89±0.49)%和(16.41±0.94)%，空白對(duì)照組、PEGFP-N1組與PEGFP-N1-HLA-G組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.05)；培養(yǎng)48 h后，各組Treg細(xì)胞占全部T淋巴細(xì)胞的比例分別為(2.22±0.69)%、(2.08±0.38)%和(16.46±0.59)%，空白對(duì)照組、PEGFP-N1組與PEGFP-N1-HLA-G組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

Fig.1CD45, CD34 and HLA-DR on placenta-derived mesenchymal stem cells were negative; CD29, CD44 and CD105 on placenta-derived mesenchymal stem cells were positive

Control PEGFP-N1 PEGFP-N1-HLA-G

Fig.2Expression of HLA-G protein in control group, PEGFP-N1 group and PEGFP-N1-HLA-G group

Tab.1HLA-G expression on placenta-derived mesenchymal stem cells in each group(n=5)

GroupRelative protein expression(%)Control100.00±0.21PEGFP-N1106.29±0.45PEGFP-N1-HLA-G210.35±0.42?#

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsPEGFP-N1 group

3 討論

在移植領(lǐng)域，Treg是臨床免疫耐受研究的重點(diǎn)之一，移植受者體內(nèi)Treg的表達(dá)對(duì)于受者體內(nèi)建立的免疫耐受和維持移植物免疫狀態(tài)起著重要作用。Treg以CD4+CD25+為主要標(biāo)志物，并特異性表達(dá)FoxP3因子，Treg可降低移植受者對(duì)外來(lái)抗原的反應(yīng)性、抑制免疫應(yīng)答的功能。因此，臨床上常常把移植受者體內(nèi)的Treg水平作為衡量移植物存活狀態(tài)的重要生物標(biāo)志物[8-10]。

HLA-G是一種非經(jīng)典MHC-I類抗原，其受體主要有三種：ILT2、ILT4和KIR2DL4。ILT4主要分布在單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等髓樣細(xì)胞表面，HLA-G/ILT4相互作用可使樹突狀細(xì)胞分泌IL10從而實(shí)現(xiàn)對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的抑制，同時(shí)活化的樹突狀細(xì)胞還可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化為CD4+CD25+FoxP3+Treg，還可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化成具有免疫抑制功能的CD3+CD4low或CD3+CD8low的Treg細(xì)胞，不表達(dá)FoxP3轉(zhuǎn)錄因子，并最終形成機(jī)體的免疫耐受[11]。若能上調(diào)移植受者體內(nèi)的HLA-G，即可誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg的產(chǎn)生，并最終實(shí)現(xiàn)受者體內(nèi)移植物在的免疫耐受[12-13]。

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞由于其來(lái)源無(wú)倫理學(xué)限制，容易獲得，且增殖速度快、免疫原性低，目前已廣泛用于移植排斥和自身免疫性疾病，是目前最具前景的間充質(zhì)干細(xì)胞之一[14]。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞又能被其他基因所修飾而表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用HLA-G基因修飾胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，觀察HLA-G陽(yáng)性的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg的效果。結(jié)果表明，HLA-G陽(yáng)性的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)24 h后可以有效地誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg，其比例占全部T淋巴細(xì)胞的(16.41±0.94)%；在混合培養(yǎng)48 h后，CD4+CD25+FoxP3+Treg比例仍然占全部T淋巴細(xì)胞的(16.46±0.59)%，而同一時(shí)間段的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg比例只占全部T淋巴細(xì)胞的(2.08±0.38)%。有研究顯示[15-16]，干細(xì)胞可以在體內(nèi)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+Treg，Treg產(chǎn)生的時(shí)間尚未明確；輸入間充質(zhì)干細(xì)胞4周左右，受者體內(nèi)可以檢測(cè)出Treg的變化，而在接受骨髓造血干細(xì)胞移植的患者體內(nèi)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)骨髓移植受者在2周內(nèi)產(chǎn)生Treg。但對(duì)于體外誘導(dǎo)的報(bào)道較少。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞作為體循環(huán)中成熟的血細(xì)胞，其分化和分裂能力較弱，若按照體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的方式，T淋巴細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)2～4周后檢測(cè)CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例，有可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的大量死亡而無(wú)法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的變化。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，HLA-G陽(yáng)性的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg的產(chǎn)生與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞相比無(wú)差異，但可維持CD4+CD25+FoxP3+Treg的體外存活時(shí)間，其作用機(jī)制可能與HLA-G蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性有關(guān)[17]。

綜上所述，由于胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞本身也具有誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg的產(chǎn)生的功能，經(jīng)過(guò)HLA-G基因修飾后胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞能夠更加有效的在體外誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Treg的產(chǎn)生，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)僅局限于體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)試驗(yàn)是否有類似的結(jié)果尚待進(jìn)一步觀察。