王佳南 林建安 杜苗苗

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2018.33.029

[摘要] 目的 探求優(yōu)化的原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞方法。 方法 2017年6月1日—2017年6月2日選取泉州市醫(yī)學高等?？茖W校提供6只出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠，采用2種不同消化心肌組織的方法，對照組予0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶逐次消化心肌組織;試驗組予0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶消化數(shù)次后再單予 0.125%胰酶快速消化心肌組織;比較兩組取得的心肌細胞數(shù)量以及存活率，免疫熒光測肌鈣蛋白鑒定純度。 結(jié)果 2種方法均得到心肌細胞數(shù)量多[對照組（103.3±4.4），試驗組（105.8±5.0）]，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.911，P=0.384）;細胞即刻存活率試驗組明顯高于對照組，試驗組達91.87%，對照組即刻存活率僅68.07%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=81.0，P=0.025）。試驗組存活率明顯高于對照組。結(jié)論 再改良方法提取心肌細胞，可獲得存活率高、活力好的心肌細胞。

[關(guān)鍵詞] 心肌細胞;原代培養(yǎng);乳鼠

[中圖分類號] R813.11? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2018）11（c）-0029-03

乳鼠心肌細胞培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應用于心血管疾病防治研究領域，其培養(yǎng)技術(shù)備受關(guān)注[1]。這一技術(shù)關(guān)鍵是如何獲得收獲率高、存活率高、純度高且生長活力好的心肌細胞。近40多年來國內(nèi)外諸多學者對乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)方法作了多次的改進，但影響心肌細胞培養(yǎng)結(jié)果的因素較多，使得心肌細胞培養(yǎng)的收獲率、存活率及活力難以穩(wěn)定，參差不齊。因此該文在既往研究方法[2]基礎上于2017年6月1日—2017年6月2日選擇6只出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠進行心肌細胞原代培養(yǎng)的再改良。

1? 材料與方法

1.1? 動物出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠

由泉州市醫(yī)學高等?？茖W校實驗動物中心提供。

1.2? 主要試劑

胰蛋白酶（Sigma）， I型膠原酶（Gibco），Ⅱ型膠原酶（Gibco）等。

1.3? 方法

①2017年6月1日于泉州市醫(yī)學高等?？茖W校實驗中心選取6只出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠，無菌下剪取心室心尖部分，在PBS液中充分洗滌，將其剪成糊狀，分成兩份置于離心管中待消化。

對照組每次予加入5 mL的0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液，每次消化10 min，如上消化6～7次。

試驗組予加入5 mL 0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液，每次消化15 min，共2次，而后單予加入5 mL 0.125%胰酶快速消化剩余組織，每次5 min，如上消化6～7次。

收取對照組和試驗組上清液，予終止消化，予過濾后離心（900 r/min，5 min），用胎牛血清重懸細胞液，接種于培養(yǎng)板中，差速貼壁去除成纖維細胞（共2次），此后由具備良好心肌細胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)驗實驗室人員對接種心肌細胞進行培養(yǎng)及管理，避免對心肌細胞形態(tài)學觀察的主觀性偏差（單盲）。

②對照組和試驗組獲取心肌細胞，倒置顯微鏡下計數(shù)獲得細胞數(shù)量，共計數(shù)6次，取均值。獲得細胞用臺盼藍染色，倒置顯微鏡下觀察心肌細胞。存活率=存活細胞數(shù)/ 細胞總數(shù)×100%，共計數(shù)40次，取均值。

③用DAPI標記細胞的細胞核，免疫熒光抗肌鈣蛋白抗體試劑標測細胞質(zhì)，檢測肌鈣蛋白抗體百分比來鑒定心肌細胞純度。

④心肌細胞的純度檢測采用免疫細胞熒光法檢測含有抗肌鈣蛋白抗體（CTNT）的百分比。細胞純度（%）=cTnT陽性細胞染色數(shù)/DAPI核染細胞總數(shù)×100%。

1.4? 統(tǒng)計方法

采用SPASS 22.0 統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)分析，兩組間計量資料比較用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，分別用（x±s）、百分率（%）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1? 比較獲取細胞數(shù)量及存活率

臺盼藍對收獲心肌細胞進行染色，死的細胞染藍色，存活細胞不染色，計算細胞總數(shù)及存活率。獲得心肌細胞數(shù)量上對照組和試驗組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.384），表1，對照組即刻存活率68.07%，試驗組達91.87%，試驗組的即刻存活率顯著高于對照組（P=0.025），見表2。

2.2? 測定心肌細胞

分別取對照組和試驗組培養(yǎng)心肌細胞（由具備心肌細胞培養(yǎng)技術(shù)其他實驗室人員執(zhí)行），DAPI標記細胞核，熒光肌鈣蛋白抗體標記細胞質(zhì)，見圖1。用倒置熒光顯微鏡觀察，所有細胞DAPI染色后細胞核呈藍色熒光（圖A）心肌細胞經(jīng)肌鈣蛋白抗體標記后顯示綠色熒光（圖B）。

3? 討論

乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)目前作為心血管疾病研究的一項基本技術(shù)。傳統(tǒng)Simpson法在實際應用中發(fā)現(xiàn)存在不足，其細胞收獲量及存活率很低，因此一些改進方法應運而生。該研究在既往心肌細胞培養(yǎng)方法基礎上進行再次改良，研究中采用了不同次序0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶+0.125%胰酶聯(lián)合消化方法，簡單快捷的分離出較多數(shù)量的心肌細胞，獲取心肌細胞數(shù)量達6×106，此與近期其他文獻報道[3-4]獲取心肌細胞數(shù)量相一致。歸其原因考慮心肌組織中含有多種類型的間質(zhì)膠原，單一消化酶難以把心肌組織充分解離成單個細胞，而實驗中兩組均采用I型和II型膠原酶與胰酶組成混合消化酶，能較有效的把成團心肌組織充分消化，把含有多種類型間質(zhì)膠原的心肌組織充分解離，因而兩組均獲得較多數(shù)量心肌細胞。在相關(guān)研究報道[5-7]中獲得心肌細胞存活率約在80%～90%左右不等，但文獻報道消化方法參差不齊，有的則較為繁瑣，而本試驗中通過前期基礎上進行改良，改良試驗組獲取心肌細胞存活率達91.87%，改良試驗組獲得的心肌細胞存活率較其他研究報道的細胞存活率略有提高，而心肌組織的消化方法相比則更為簡便。在該研究中對照組獲取細胞即刻存活率僅68.07%，與改良試驗組比較差異有統(tǒng)計學意義，為何兩組采用相同的混合消化酶消化心肌組織，但試驗組細胞存活率明顯高于對照組，考慮與胰酶消化時間明顯相關(guān)。試驗組采用5 mL 0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液消化15 min（共2次），而后加入5 mL 0.125%胰酶快速消化剩余組織5 min的消化次序，這樣先把心肌組織團塊較長時間置于溫和而對心肌細胞損傷極小的混合膠原酶中充分消化解離，把心肌團塊消化解離成松散的心肌組織，而后迅速置于消化作用強而對細胞損傷相對較大的胰酶中快速消化，采用此種消化方法可縮短心肌組織和細胞損傷較強的胰酶消化液接觸時間，因而獲取細胞存活率高，而對照組予加入5 mL的0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶混合液，每次消化作用10 min，共消化6～7次，采用此種消化方法，雖然亦可比較充分消化心肌組織，但心肌細胞和胰酶消化液總的接觸時間較長，而胰蛋白酶對細胞膜有較大破壞作用，時間過長容易過度消化損傷心肌細胞膜，導致細胞壞死。心肌細胞原代培的影響因素眾多[8-9]，筆者經(jīng)過反復實踐證實消化酶的選擇及消化方法是心肌細胞分離培養(yǎng)最關(guān)鍵重要因素。傳統(tǒng)消化心肌細胞最常用的是胰蛋白酶，其分解細胞的組織間質(zhì)蛋白，然而其對細胞膜有較大損傷，假如濃度太高或消化時間太長則容易過度消化心肌細胞，損傷心肌細胞的細胞膜，使得心肌細胞喪失貼壁能力及心肌搏動活力，此外心肌組織有很多膠原成分，單獨應用胰蛋白酶消化心肌組織沒有辦法充分解離出多的單個細胞。而組織膠原酶，可分解細胞之間的膠原成分，本身對心肌細胞的損傷很小，把成團的心肌組織塊分解成松散單個細胞很有好處，然而其溫和的分解作用，勢必導致消化組織需要耗時大量時間，此外，由于心肌組織間質(zhì)膠原具有多種類型，應用某一種膠原酶效果亦有限，基于此，筆者采用了0.125%胰酶+0.05%I型膠原酶+0.1%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化方法，簡單快捷的分離出良好的心肌細胞，用此法培養(yǎng)的心肌細胞可以滿足各種體外試驗的要求。

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（收稿日期：2018-08-25）