徐麗麗，解春霞，鄭華英，劉云鵬

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153)

管氏腫腿蜂(Sclerodermusguani)，屬膜翅目(Hymenoptera)青蜂總科(Chrysidoidea)硬皮腫腿蜂屬，是多種林木鉆蛀性害蟲的體外寄生蜂[1]。該天敵昆蟲的寄主類別多，分布區(qū)域廣泛，且寄生效果好，已大規(guī)模應(yīng)用于林業(yè)鉆蛀性害蟲的生物防治，可以有效地防治松墨天牛(Monochamusalternatus)、光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)、雙條杉天牛(Semanotusbifasciatus)和青楊天牛(SaperdapopulneaL.)等[2-4]。

寄主昆蟲被寄生蜂寄生后，其體內(nèi)血淋巴和脂肪體中各物質(zhì)的濃度發(fā)生變化，以利于寄生蜂幼蜂的生長發(fā)育[5-6]。管氏腫腿蜂對寄主的寄生屬抑性寄生，其蜇刺會導(dǎo)致寄主麻痹和中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，注射的相應(yīng)物質(zhì)能夠有效抑制寄主的氧化反應(yīng)，對于雌蜂產(chǎn)卵后寄主的防腐以及為下一代幼蟲的生長發(fā)育提供相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)至關(guān)重要[7-8]。蛋白質(zhì)是生物體生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。椰心葉甲幼蟲被寄生后，表皮蛋白質(zhì)含量顯著降低[9]；小蜂(Euplectrussp. nearplathypenae)寄生東方粘蟲(Pseudaletiaseparata)后寄主脂肪體中蛋白質(zhì)含量先升后降，血淋巴中蛋白質(zhì)持續(xù)上升[10]。棉大卷螟甲腹繭蜂(Chelonusinanitus)寄生夜蛾(Spodopteralittoralis)，蝶蛹金小蜂(Pteromaluspuparum)寄生菜粉蝶(Pierisrapae)后，寄主血淋巴中的蛋白質(zhì)含量變化趨勢不同[11-12]。本文從管氏腫腿蜂寄生后寄主體內(nèi)各部位——蟲體、脂肪體(營養(yǎng)物質(zhì)儲存和代謝加工器官)、血淋巴(幼蜂的主要營養(yǎng)來源)、表皮(寄主保護作用)蛋白質(zhì)含量的變化進行研究，探索雌蜂對寄主體內(nèi)的營養(yǎng)轉(zhuǎn)向的調(diào)節(jié)，旨在為該天敵昆蟲的林間應(yīng)用提供新的室內(nèi)試驗證據(jù)和理論依據(jù)，為寄生蜂的繁育過程提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本次試驗所用松墨天牛，于2017年12月采集自溧陽天目湖鎮(zhèn)的馬尾松上，當(dāng)天將采集到的松墨天牛帶回實驗室保存于4 ℃冷凍備用，第2天進行試驗處理。管氏腫腿蜂雌蜂種蜂購自南京康林寶生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

依據(jù)柳建定等對松墨天牛幼蟲齡期的劃分方法，選取同日采集的大小相近的5齡松墨天牛幼蟲200頭，頭殼寬為(3.881±0.177) mm[13]。隨機選取40頭作為初始組，直接測取10頭幼蟲蟲體、30頭幼蟲表皮、脂肪體和血淋巴的蛋白質(zhì)含量(各部位蛋白質(zhì)含量測定所需幼蟲頭數(shù)下同)，為第0天數(shù)據(jù)。剩余160頭隨機分成2組(各80頭)，置于口徑1 cm的玻璃管內(nèi)，其中1組接種管氏腫腿蜂，每頭松墨天牛人為接種管氏腫腿蜂雌蜂5頭，為處理組；另1組不進行接種，為對照組。進行處理后，使用棉花堵塞管口，防止松墨天牛和腫腿蜂逃逸。然后，置于江蘇省天敵生物繁育場內(nèi)，室內(nèi)溫度保持恒溫28 ℃。在以下各個時間點分別對2組松墨天牛進行蛋白質(zhì)含量測定：①處理組松墨天牛初被麻痹時(第2天)。②處理組腫腿蜂所產(chǎn)卵開始孵化時(第14天)。其中，處理組進行蛋白質(zhì)含量測定前，去除腫腿蜂雌蜂和其所產(chǎn)的卵。所有處理中每個部位蛋白質(zhì)的測定為10個重復(fù)，其中表皮、脂肪體和血淋巴由于量較少，測定時選取每3頭幼蟲進行混合作為1個重復(fù)。

1.3 血淋巴的獲取

將松墨天牛幼蟲在-20 ℃冷凍麻痹3 min，取出后用75%的酒精清洗體表，后用pH 7.4的PBS清洗干凈，在濾紙上擦干體表，稱取質(zhì)量。解剖時，用干凈的解剖剪在幼蟲胸腹處剪出微小口子，用毛細(xì)管吸取血淋巴后，轉(zhuǎn)移到冰浴條件下的已加入少許苯硫脲晶體的0.5 mL離心管中[14]。

1.4 脂肪體的獲取

選取松墨天牛幼蟲，在75%酒精中消毒后，置于解剖鏡下，使用鑷子按住頭部，用消毒過的尖嘴鑷夾住幼蟲的尾節(jié)，輕輕拉出完整的中腸、馬氏管，再去除頭部，后沿腹中線縱向剪開幼蟲蟲體，用鑷子和藥勺將脂肪體刮到5 mL離心管中[15]。

1.5 表皮的獲取

將已進行脂肪體收集的樣品，取下體壁，在解剖鏡下，小心刮去肌肉組織及皮細(xì)胞層，用蒸餾水沖洗干凈，在濾紙上擦干后收集置2 mL離心管中[16]。

1.6 蛋白質(zhì)的測定方法

考馬斯亮藍法。使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白-考馬斯亮藍G-250溶液，制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。稱取松墨天牛樣品(蟲體、脂肪體、表皮)質(zhì)量后(W)，放入研缽中，加入5 mL蒸餾水在冰浴中研磨勻漿，離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液用于蛋白質(zhì)含量的測定。取0.1 mL上清液(血淋巴直接取0.1 mL)，加入蒸餾水0.9 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，室溫靜置2 min后，以加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑和1mL蒸餾水的試管作參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量C(μg/mL)。

最終所得蛋白質(zhì)含量X(mg/g) =C×5/(1 000×W)。

C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查樣品提取液中的蛋白質(zhì)含量(μg/mL)；

W—樣品質(zhì)量(g)；

5—樣品提取液體積(mL)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與計算分析使用了Microsoft Office Excel(微軟公司，美國)；數(shù)據(jù)的方差分析與相關(guān)折線圖使用Graphpad Prism 5(Graphpad公司，美國)軟件，差異性分析使用單因素方差分析，Tukey’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體

松墨天牛蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量變化如圖1所示。處理組天牛蟲體蛋白質(zhì)含量，在麻痹初期(第2天)極顯著高于初始組和同期對照組；在幼蜂初孵時(第14天)極顯著低于麻痹初期和同期對照組。而對照組，第14天的蟲體蛋白質(zhì)含量顯著高于第2天和初始組，且第2天與初始組無顯著差異。

圖1 松墨天牛蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量變化

2.2 表皮

圖2 松墨天牛表皮中蛋白質(zhì)含量變化

松墨天牛表皮中的蛋白質(zhì)含量變化如圖2所示。處理組蛋白質(zhì)含量，在麻痹初期極顯著低于初始組和同期對照組；在幼蜂初孵時，與麻痹初期和同期對照組無顯著差別。而對照組，第2天的蛋白質(zhì)含量與初始組無顯著差別，第14天極顯著低于初始組和第2天。

2.3 血淋巴

松墨天牛血淋巴的蛋白質(zhì)含量變化如圖3所示。由圖可知，處理組天牛血淋巴蛋白質(zhì)含量，在麻痹初期顯著高于初始組，但與同期對照組無顯著差異；在幼蜂初孵時，顯著高于麻痹初期和同期對照組。對照組血淋巴蛋白質(zhì)含量在各時間點未見顯著差異。

圖3 松墨天牛血淋巴中蛋白質(zhì)含量變化

2.4 脂肪體

圖4 松墨天牛脂肪體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化

松墨天牛脂肪體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化如圖4所示。處理組天牛脂肪體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，在麻痹初期顯著高于同期對照組，但與初始組無顯著差異；在幼蜂初孵時，顯著低于麻痹初期和同期對照組。對照組，第2天蛋白質(zhì)含量顯著低于初始組，與第14天的2組之間未見顯著差異。

3 結(jié)論與討論

處理組松墨天牛蟲體和脂肪體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量在第2天均顯著高于初始組，蟲體蛋白質(zhì)含量在第14天顯著低于第2天，與同期對照組相反。寄主松墨天牛各部位之間的蛋白質(zhì)含量變化有所不同，表皮的變化與其他部位不同，蟲體的變化與脂肪體相似。

在試驗過程中，寄主松墨天牛無法進行取食，其體內(nèi)各部位的蛋白質(zhì)含量變化，除卻自身消耗外，與寄生蜂的蜇刺與取食密切相關(guān)。在幼蜂初孵時，處理組脂肪體蛋白質(zhì)含量顯著低于同期對照組，而血淋巴中蛋白含量則相反，與黃芳的研究相一致[18]。可能是由于脂肪體是重要的代謝加工器官，天牛營養(yǎng)物質(zhì)的消耗與轉(zhuǎn)化最先開始于脂肪體，其內(nèi)的蛋白質(zhì)向血淋巴轉(zhuǎn)移[19]。處理組蟲體蛋白質(zhì)含量，在麻痹初期顯著高于初始組和同期對照組，與Cnsoli等(2005)的研究結(jié)果相類似[20]；而在幼蜂初孵時低于同期對照組和麻痹初期，可見在第2—14日中，寄主體內(nèi)可能存在蛋白質(zhì)向其他更易被寄生蜂幼蟲吸收的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化。本次研究中發(fā)現(xiàn)處理組松墨天牛在麻痹初期蛋白質(zhì)含量高于初始組，與吳華的研究發(fā)現(xiàn)松墨天牛被管氏腫腿蜂寄生后蟲體蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降有所不同[5]，可能與選取的時間點不同有關(guān)。腫腿蜂的蜇刺對寄主松墨天牛的蛋白質(zhì)含量進行了調(diào)節(jié)與控制，使其向有利于子代幼蟲取食、吸收、發(fā)育的方向變化，與Vinson 等提出的“寄生調(diào)節(jié)”理念相符[21]。

較之初始組，處理組松墨天牛，蟲體、脂肪體和血淋巴中蛋白質(zhì)含量在麻痹初期顯著增加，而表皮則相反；在幼蜂初孵時，蟲體與脂肪體蛋白質(zhì)含量顯著低于麻痹初期，而表皮與血淋巴則相反；蟲體的變化與脂肪體的變化相似。血淋巴中的蛋白質(zhì)含量在麻痹初期和幼蜂初孵時皆高于同期對照組，且隨時間變化含量升高。各部位蛋白質(zhì)含量在幼蜂初孵前與同期對照組相比，表皮未見差異，蟲體和脂肪體處理組皆顯著低于對照組。Alleyne等的研究認(rèn)為寄生蜂可以通過調(diào)節(jié)脂肪體的代謝來調(diào)控血淋巴中的生化變化[22]，可見雌蜂蜇刺松墨天牛后不僅存在蛋白質(zhì)向其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化的可能，還存在蟲體其他部位的蛋白質(zhì)向血淋巴轉(zhuǎn)移的可能。