楊永寧

（青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 西寧 812100）

牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，李英利等于2011年首次從內(nèi)蒙古腹瀉犢牛中分離鑒定出了國(guó)內(nèi)第一株BEV，隨后我國(guó)研究學(xué)者從山東、山西、北京、吉林等地陸續(xù)分離鑒定出不同基因型的BEV，BEV在我國(guó)牛群中的流行正在逐步增加。一般認(rèn)為BEV單獨(dú)感染的致病性不強(qiáng)，只引起輕度腹瀉或隱性感染，但BEV常常與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，進(jìn)而暴發(fā)以繁殖障礙、腹瀉為主要特征的傳染病，導(dǎo)致死亡率升高，降低養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，危害養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。牦牛是我國(guó)高原牧區(qū)特有的一個(gè)獨(dú)立物種，是當(dāng)前青海省農(nóng)村飼養(yǎng)的主要家畜，也是青海牧區(qū)群眾重要的生活與生產(chǎn)資料。近年來(lái)隨著青海省牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牦牛腹瀉的發(fā)生率逐漸升高，為全面掌握青海省西寧市牦牛群中BEV的感染現(xiàn)狀，本研究利用一步法RT-PCR方法首次對(duì)2017—2018年采集于西寧市的259份牦牛糞便樣品進(jìn)行了BEV的病原學(xué)檢測(cè)與分析，為西寧市牦牛BEV綜合防控措施的制定提供了數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2017-2018年共采自青海省西寧市城東區(qū)、城西區(qū)、城北區(qū)、大通縣、湟中縣、湟源縣共計(jì)6個(gè)區(qū)（縣）的牦牛糞便樣品259份，其中臨床中已表現(xiàn)出腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品74份，臨床中無(wú)腹瀉癥狀的健康牦牛糞便樣品185份。

1.2 試劑盒

病毒基因組RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

參照陳新諾等的方法設(shè)計(jì)合成一對(duì)BEV特異性檢測(cè)引物（P1：5’-GGCGC TAGTACTCTGG TACG-3’；P2：5’-CGCGTTA C GACGTA GCAA-3’），預(yù)擴(kuò)增片段大小為556bp。

1.4 核酸提取

利用病毒基因組RNA提取試劑盒分別提取采集的259份牦牛糞便樣品的核酸RNA。

1.5 一步法RT-PCR擴(kuò)增

以提取的RNA為模板，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒并參照陳新諾等的PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。一步法RTPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄40min；94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，59℃退火 30s，68℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min；4℃終止反應(yīng)。

1.6 電泳檢測(cè)

一步法RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外成像儀下觀察檢測(cè)結(jié)果，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行BEV感染情況的統(tǒng)計(jì)分析，分別掌握青海省西寧市不同地區(qū)腹瀉牦牛群和健康牦牛群中BEV的感染現(xiàn)狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹瀉牦牛樣品的檢測(cè)結(jié)果

如表1所示，采用一步法RT-PCR方法對(duì)2017—2018年采自青海省西寧市不同地區(qū)的共計(jì)74份腹瀉牦牛糞便樣品進(jìn)行BEV的病原學(xué)檢測(cè)，共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品24份，平均陽(yáng)性感染率為32.43%，其中湟中縣的陽(yáng)性感染率最高，達(dá)47.06%；湟源縣次之，為42.86%；城西區(qū)的陽(yáng)性感染率最低，僅為12.50%。該結(jié)果表明西寧市不同地區(qū)的腹瀉牦牛群中均存在BEV的感染，且不同地區(qū)感染率差異較大，部分地區(qū)陽(yáng)性感染率較高。

2.2 健康牦牛樣品的檢測(cè)結(jié)果

如表2所示，采用一步法RTPCR方法對(duì)2017—2018年采自青海省西寧市不同地區(qū)的共計(jì)185份健康牦牛糞便樣品進(jìn)行BEV的病原學(xué)檢測(cè)，共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品33份，平均陽(yáng)性感染率為17.84%，其中湟中縣的陽(yáng)性感染率最高，達(dá)26.19%；湟源縣次之，為24.32%；城北區(qū)的陽(yáng)性感染率最低，僅為5.56%。該結(jié)果表明西寧市不同地區(qū)的健康牦牛群中均存在BEV的感染，且不同地區(qū)感染率差異較大，部分地區(qū)陽(yáng)性感染率較高。

表2 健康牦牛樣品的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近來(lái)來(lái)，隨著我國(guó)牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牦牛BEV的流行率也隨之逐步增加，陳新諾等應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)青藏高原地區(qū)222份腹瀉牦牛糞便樣品進(jìn)行了BEV的流行病學(xué)調(diào)查，BEV平均陽(yáng)性感染率為29.40%；何歡等應(yīng)用RTPCR方法對(duì)青藏高原地區(qū)235份腹瀉牦牛糞便樣品和116份健康牦牛糞便樣品進(jìn)行了BEV的流行病學(xué)調(diào)查，腹瀉牦牛陽(yáng)性感染率為31.06%，健康牦牛陽(yáng)性感染率為24.14%。本研究采用RT-PCR方法首次對(duì)2017—2018年采自青海省西寧市城東區(qū)、城西區(qū)、城北區(qū)、大通縣、湟中縣、湟源縣的74份腹瀉牦牛糞便樣品和185份健康牦牛糞便樣品進(jìn)行了BEV的核酸檢測(cè)與分析，結(jié)果顯示西寧市不同縣區(qū)腹瀉牦牛和健康牦牛中均存在BEV的感染，其中不同縣區(qū)腹瀉牦牛陽(yáng)性感染率在12.50%~47.06%之間，平均陽(yáng)性感染率為32.43%，不同縣區(qū)健康牦牛陽(yáng)性感染率在5.56%~26.19%之間，平均陽(yáng)性感染率為17.84%。本次調(diào)查結(jié)果與陳新諾等、何歡等對(duì)牦牛感染BEV的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果基本一致，表明我國(guó)牦牛群中已存在BEV的感染與流行，部分地區(qū)陽(yáng)性感染率較高，且健康牦牛群中也能檢測(cè)到BEV的存在，可見(jiàn)BEV能夠在牦牛群及其生活環(huán)境中肆意傳播，BEV一旦和其他致病原混合感染將導(dǎo)致牦牛患有多種臨床疾病甚至死亡，其造成的危害不容小視，加強(qiáng)牦牛BEV的綜合防控已迫在眉睫?！?/p>