趙敬翠

（遼寧省朝陽市建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 朝陽 122400）

β-激動劑類藥物，又名β-興奮劑類藥物，俗稱瘦肉精，因具有吸收快的特性，可提高胴體瘦肉率，被廣泛用于飼料中。人食用含有“瘦肉精”的肉或內(nèi)臟，15～20min起作用且維持時間持久，會造成群體性的惡性食物中毒，嚴重的可致人死亡。因此，國家規(guī)定通過酶聯(lián)免疫法檢測豬肉中β-激動劑類藥物為不得檢出。

本文用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測豬肉中β-激動劑類藥物的含量，其原理是待測樣品中的β-激動劑類藥物殘留與微孔包被的抗原共同競爭特異性抗體，當樣品中β-激動劑類藥物含量少時，更多的抗體就會與酶標板微孔上的抗原結(jié)合而被固定在酶標板上，通過酶催化底物顯色反應(yīng)，顏色為深藍色；樣品中β-激動劑類藥物含量多時，顏色為淺藍色。

1 實驗材料

1.1 樣品前處理在我縣轄區(qū)內(nèi)屠宰廠隨機抽取代表性樣品（豬肉）40批次，每個樣品抽取豬肉200g，精確秤取1±0.01g均質(zhì)后的樣品于50mL離心管中；加入3mL 0.5%三氯乙酸高速渦動1min，4000g以上離心5min；取1mL中間層清液于新的離心管中；加40μL 0.5M 氫氧化鈉溶液，渦動10s混勻，4000g以上離心5min；立即取40μL檢測。

1.2 試劑盒β-激動劑類酶聯(lián)免疫試劑盒（96孔）。購自北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑盒回溫將試劑盒內(nèi)各組份取出置于23～27℃室溫下30min。

1.4 添加陽性對照根據(jù)標準曲線確定陽性對照濃度為2ppb，取濃度8.1ppb標準品247.0μL添加到1g空白樣品中，成為濃度2ppb陽性對照品，計算陽性對照回收率。處理同前。

2 檢測步驟

取出酶標板，每個樣品都做雙孔平行，記錄標準品、陽性對照品和樣品位置。

在96孔酶標板微孔中依次加入標準品工作液、陽性對照品、陰性對照品和其它待測樣品均為40μL。添加不同樣品時更換槍頭，防止交叉污染。

再每孔分別加入酶標記物工作液60μL。酶標記物工作液應(yīng)輕柔混勻后立即用，不能存放。

蓋好蓋板膜，輕輕振蕩10s使之充分混勻，室溫（23～27℃）避光反應(yīng)30min。

揭開蓋板膜，倒掉孔中液體，每個酶標板微孔中加入260μL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15min立即加入底物AB混合液100μL（等比例充分混合，5min內(nèi)使用，液體盛裝、攪拌不能使用金屬物質(zhì)）。

蓋好蓋板膜，輕輕振蕩10s，充分混勻，室溫（23～27℃）下避光反應(yīng)15～20min。

揭開蓋板膜，每孔中加入終止液50μL，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻。

終止后5min內(nèi)用酶標儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標板吸光度值，并將數(shù)值打印出來。

3 計算陽性對照回收率

利用電腦數(shù)據(jù)分析軟件r-biopharm，手動錄入測得的數(shù)值，軟件自動對檢測結(jié)果進行分析，同時繪制標準曲線并得出所有檢測樣品中β-激動劑類藥物的含量。回收率（%）=（實測陽性對照濃度—實測陰性對照濃度）÷添加濃度（2ppb）×100%，本次檢測回收率為95%，在75%～105%，說明此次檢測和結(jié)果準確性高。

4 討論

試劑盒貯存溫度為2～8℃，酶標記物常溫下易變性。待測樣品原則上必須馬上檢測，如不能及時檢測，要將樣品冷凍保存。

加樣時移液槍應(yīng)垂直于板孔，防止將液體加在孔壁上部；加同種等量液體時應(yīng)選用多道移液槍，可提高速度，節(jié)省實驗操作時間，確保檢測結(jié)果的準確度。

實驗中應(yīng)嚴格按照避光反應(yīng)溫度和時間，因為抗原與抗體結(jié)合的機會不均等，需要一定的時間和溫度。優(yōu)先與貼近孔壁的一層溶液中的抗原反應(yīng)，是逐步平衡的過程。

洗板主要靠洗滌使游離的與結(jié)合的酶標記物的達到分離目的。如果洗滌次數(shù)不夠、注入的洗滌液量不足或洗板間隔太久會直接影響檢測的結(jié)果，甚至使實驗失敗。另外，洗板后要在亮光處觀察微孔底部是否有氣泡，氣泡可用干凈的槍頭戳破，戳不同孔底的氣泡應(yīng)更換槍頭。

酶聯(lián)免疫法具有快速、靈敏、方便等特點，適用于大批量樣品篩查。而其他檢測藥物殘留的方法也在逐步完善并應(yīng)用于縣區(qū)檢測中。