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(鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000)

0 引言

流感病毒屬于正粘病毒科，基因組是單股、負(fù)鏈、多節(jié)段的核糖核酸(RNA)分子。根據(jù)流感病毒核蛋白(NP)抗原性差異，可將流感病毒分為A、B、C三型，其中A型流感病毒為最常見的流感病毒，宿主范圍廣泛，可感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物、家禽以及野鳥。根據(jù)流感病毒表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)氨基酸的差異，又可將A型流感病毒分為多個(gè)HA亞型和NA亞型。禽流感病毒屬于A型流感病毒，根據(jù)致病能力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和非致病性禽流感。高致病性禽流感傳染性極強(qiáng)，以高發(fā)病率和高致死率為特征，對(duì)禽類養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報(bào)的動(dòng)物疾病，中國(guó)政府也將其列為一類動(dòng)物疫病，引起HPAI的毒株主要集中在H5和H7亞型[1-2]。

2013年，我國(guó)上海、江蘇和浙江等地先后發(fā)生H7N9禽流感病毒感染人事件，并引起死亡[3]。分子流行病學(xué)資料表明，2017年從病人體內(nèi)分離的H7N9病毒出現(xiàn)血凝素裂解位點(diǎn)突變，該突變提示病毒致病性可能發(fā)生變化，進(jìn)一步危害公共衛(wèi)生安全[4]。

本研究以禽流感病毒H7N9亞型HA裂解位點(diǎn)和NA基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為模型，建立一種敏感、特異、多重高效的流感病毒核酸檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

引物和探針委托華大基因合成；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶采購(gòu)自takara公司；PCR常規(guī)試劑均采購(gòu)自賽默飛公司；H7N9病毒和其他常見禽病病毒核酸由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物探針制備

參考GenBank毒株序列KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，使用NCBI提供的在線工具Primer-BLAST進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。

1.2.2 陽性對(duì)照制備

參考GenBank毒株序列KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增H7N9經(jīng)典毒株HA基因，變異毒株HA基因和NA基因，并將3個(gè)基因片段連接到pUC57質(zhì)粒。用常規(guī)方法提取質(zhì)粒，并用無Rnase純化水稀釋至2×106copies/μL，置-20℃以下保存。

1.2.3 陰性對(duì)照制備

量取1 mL焦炭酸二乙酯迅速加入裝有1 000 mL去離子水的瓶中，封口，震蕩混勻，2℃～8℃放置8～16 h。121℃高壓滅菌25 min，置-20℃以下保存。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng)條件及閾值判定

根據(jù)不同探針設(shè)置對(duì)應(yīng)的熒光通道，確定RT-PCR反應(yīng)程序及方法閾值。

1.2.5 敏感性試驗(yàn)

將H7N9經(jīng)典毒株和變異毒株核酸混合，按10倍梯度進(jìn)行稀釋，用本方法檢測(cè)。

1.2.6 特異性試驗(yàn)

使用該方法檢測(cè)H5、H9等其他亞型禽流感病毒，以及其他禽類常見病毒核酸，包括H7N9變異毒株、H7N9經(jīng)典毒株、新城疫病毒、傳染性法式囊病病毒、禽白血病病毒、禽傳染性支氣管炎病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 引物探針制備

用于檢測(cè)H7N9病毒HA基因的引物對(duì)及其探針序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’；H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’；H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’；ROX為熒光基團(tuán)，BHQ-2為淬滅基團(tuán)。

用于檢測(cè)H7N9變異毒株HA基因的引物對(duì)及其探針序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’；H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’；H7變異-P：5’-FAM-AGAGAAAACGGACTGC-BHQ1-MGB-3’；FAM為熒光基團(tuán)，BHQ-1為淬滅基團(tuán)。

用于檢測(cè)H7N9病毒NA基因的引物對(duì)及其探針序列如下：N9-F：5’-ATGCCCAGTAGTGTTCACCG-3’；N9-R：5’-TGTCCTCCCTAGCCAAGTGT-3’；N9-P：5’-VIC-GTCTCTGACTGGAACT-BHQ1-MGB-3’；VIC為熒光基團(tuán)，BHQ-1為淬滅基團(tuán)。

上述引物和探針由華大基因公司合成。

2.2 RT-PCR反應(yīng)程序

在熒光定量PCR儀上運(yùn)行以下程序：42℃30 min，95℃3 min；然后進(jìn)行94℃10 s，60℃30 s；40個(gè)循環(huán)。熒光通道選擇FAM、VIC、ROX，其中FAM用于檢測(cè)突變毒株HA基因，ROX用于檢測(cè)野生株HA基因，VIC用于檢測(cè)NA基因，在每個(gè)循環(huán)的60℃時(shí)收集熒光信號(hào)。設(shè)置擴(kuò)增體系為20 μL，同時(shí)要選擇passive reference和quencher為none的模式。

2.3 基線和閾值設(shè)定

基線調(diào)整取6～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對(duì)照檢測(cè)熒光曲線的最高點(diǎn)；質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)束后，陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線或Ct值>37或無；陽性對(duì)照Ct值均≤30.0，且出現(xiàn)三條明顯的擴(kuò)增曲線，否則實(shí)驗(yàn)視為無效；樣品判定：待檢樣品若FAM、ROX和VIC三條通道熒光信號(hào)均有指數(shù)型增加，且結(jié)果均顯示Ct值<34.0，則報(bào)告為高致病H7N9陽性；待檢樣品若ROX和VIC兩條通道熒光信號(hào)均有指數(shù)型增加，且結(jié)果均顯示Ct值<34.0，則報(bào)告為低致病H7N9陽性；待檢樣品若Ct值>37.0或無明顯擴(kuò)增曲線時(shí)報(bào)告為陰性；34≤Ct值≤37時(shí)，復(fù)檢一次，重復(fù)結(jié)果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。

2.4 敏感性試驗(yàn)

將H7N9經(jīng)典毒株和變異毒株陽性核酸混合，按10倍梯度進(jìn)行稀釋。用本方法檢測(cè)稀釋樣本，靈敏度可以達(dá)到100～101個(gè)EID50。

2.5 特異性試驗(yàn)

本方法具有良好的特異性，檢測(cè)結(jié)果不受其他亞型流感病毒以及常見禽類病毒的干擾，并且能夠鑒別在對(duì)H7N9變異毒株和經(jīng)典毒株核酸樣本。

3 討論

本研究開發(fā)了一種用于檢測(cè)H7N9禽流感病毒經(jīng)典毒株和變異毒株的多重?zé)晒釸T-PCR核酸檢測(cè)試劑盒，利用多重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)，可快速、高效地甄別人和動(dòng)物中的H7N9低致病性經(jīng)典毒株和高致病性變異毒株。本研究以H7N9禽流感病毒HA裂解位點(diǎn)突變位置的基因序列為分子標(biāo)識(shí)設(shè)計(jì)MGB探針，建立H7N9病毒經(jīng)典毒株和變異毒株血凝素(HA)雙重檢測(cè)體系，然后結(jié)合保守的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因檢測(cè)體系，組成三重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。

本研究使用MGB-Taqman探針，克服了多重PCR引物、探針、目的產(chǎn)物相互干擾等問題。探針3’末端使用BHQ作為淬滅基團(tuán)，而BHQ本身不產(chǎn)生熒光，熒光背景低，靈敏度高；在傳統(tǒng)Taqman探針基礎(chǔ)上，MGB-Taqman探針在3’末端偶聯(lián)MGB (Minor Groove Binder)。MGB能夠與DNA的小溝結(jié)合，使探針與靶DNA形成極為穩(wěn)定的異源雙鏈，從而可將Tm值提高約10℃，大大提高了熒光PCR方法的特異性；MGB探針較短(14～20bp)，因而更適合于短小變異序列的特異性識(shí)別，容易設(shè)計(jì)。而且3’端淬滅基團(tuán)與3’端報(bào)告基因在空間的位置更接近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確，分辨率更高。