湯加勇，趙 華，斯小東

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營養(yǎng)研究所，四川 成都 611130；2.成都瑞智騰揚(yáng)機(jī)電設(shè)備有限公司，四川 成都 611130)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)和基本技能，也是細(xì)胞工程、基因工程和生物醫(yī)學(xué)工程的重要研究手段。細(xì)胞培養(yǎng)室是綜合實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)重要組成部分。擁有好的細(xì)胞培養(yǎng)室，是保證實(shí)驗(yàn)研究順利開展的基礎(chǔ)條件之一，同時(shí)也能提高科研質(zhì)量。對(duì)各科研高校及研究所來說，很多學(xué)科都根據(jù)自己科研需求建有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，但其規(guī)模、級(jí)別、使用效率、管理模式等方面都缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，普遍存在規(guī)模小，設(shè)計(jì)不合理，建設(shè)不規(guī)范，資金浪費(fèi)，配套跟不上，缺乏有效的管理等諸多問題[1]。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)是一所以生物科技為特色，農(nóng)業(yè)科技為優(yōu)勢，多學(xué)科協(xié)調(diào)發(fā)展的國家“211工程”重點(diǎn)建設(shè)大學(xué)和國家一流學(xué)科建設(shè)高校，也是教育部本科教學(xué)工作水平評(píng)估優(yōu)秀高校。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所主要從事豬、禽、草食動(dòng)物和水生動(dòng)物的營養(yǎng)需要、營養(yǎng)代謝與調(diào)控、飼料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定、飼料加工配制技術(shù)，以及交叉領(lǐng)域如抗病營養(yǎng)、分子營養(yǎng)、營養(yǎng)與微生態(tài)學(xué)等的研究。隨著學(xué)科發(fā)展和新實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃，研究所于2014年著手在新校區(qū)(成都校區(qū))設(shè)計(jì)、施工建設(shè)細(xì)胞培養(yǎng)室，并于2015年底正式投入使用，在使用過程中表現(xiàn)良好，但也出現(xiàn)了一些問題。本文就該細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)、建設(shè)、管理制度以及出現(xiàn)的問題等方面進(jìn)行介紹，與廣大同行進(jìn)行探討。

1 細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)與建設(shè)

細(xì)胞培養(yǎng)室是在原有普通實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)上改建而成，原實(shí)驗(yàn)室面積約140m2，基本屬于梯形狀。由于房間異型以及面積的限制，同時(shí)又考慮到研究所對(duì)無菌操作間數(shù)量的需求以及消防安全等方面要求，細(xì)胞培養(yǎng)室的最終平面設(shè)計(jì)圖如圖1所示[2-3]，且細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)潔凈度均達(dá)到十萬級(jí)。該培養(yǎng)室共有無菌培養(yǎng)房6間，儀器室4間，緩沖更衣室1間，前處理消洗室1間，風(fēng)淋室1間，不銹鋼傳遞窗2個(gè)，緩沖潔凈走廊1條。培養(yǎng)室內(nèi)凈高2.3m，隔斷和天花板均采用手工玻鎂中空彩鋼板(陽角和陰角均采用圓角過渡)，地面采用醫(yī)用PVC地膠。為了保證火災(zāi)發(fā)生時(shí)及緊急情況下室內(nèi)人員的安全，特設(shè)計(jì)了兩扇密閉全玻璃潔凈門，緊急情況下可破門而出。其中一扇位于原實(shí)驗(yàn)室后門處(圖1中右上角)，設(shè)置在房間內(nèi)的目的是為多增加一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)間；另一扇位于風(fēng)淋室旁緩沖潔凈走廊盡頭，此門只能在潔凈區(qū)內(nèi)打開，主要是確保風(fēng)淋室系統(tǒng)出現(xiàn)故障關(guān)閉時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員可通過此門離開房間。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)室平面設(shè)計(jì)圖

1.1 空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)

本培養(yǎng)室采用凈化回風(fēng)加新風(fēng)空調(diào)設(shè)備系統(tǒng)，空氣經(jīng)過初效、中效和高效空氣過濾器三級(jí)過濾后送入室內(nèi)[4]。初效和中效空氣過濾器設(shè)置在空調(diào)機(jī)組內(nèi)，高效空氣過濾器設(shè)置在系統(tǒng)末端的高效送風(fēng)口內(nèi)。室外新風(fēng)與室內(nèi)回風(fēng)混合經(jīng)過空調(diào)機(jī)的初效過濾、冷卻降溫(加熱升溫)，經(jīng)中效過濾和房間內(nèi)的高效過濾風(fēng)口送入凈化房間。采用頂送風(fēng)側(cè)下回風(fēng)的方式，送風(fēng)量大于回風(fēng)量，以保持室內(nèi)正壓。非潔凈區(qū)域(緩沖/更衣間、前處理消洗室)共用一套通排風(fēng)系統(tǒng)；凈化區(qū)域獨(dú)立設(shè)計(jì)一套凈化空調(diào)系統(tǒng)，凈化級(jí)別為十萬級(jí)。

本培養(yǎng)室正好位于頂樓，為節(jié)省空間，將中央空調(diào)外機(jī)放置于樓頂?？照{(diào)風(fēng)機(jī)通過設(shè)置于送風(fēng)主管道上的風(fēng)量傳感器和總送風(fēng)電動(dòng)閥對(duì)房間送風(fēng)量進(jìn)行精確控制。在每個(gè)培養(yǎng)間和儀器室設(shè)置獨(dú)立回風(fēng)系統(tǒng)，通過回風(fēng)主管道上的電動(dòng)比例積分閥控制房間回風(fēng)總量，以保證潔凈室內(nèi)的壓差；通過溫濕度傳感器對(duì)進(jìn)入空調(diào)機(jī)組的冷熱量進(jìn)行調(diào)節(jié)，以保證房間的溫濕度。新風(fēng)管上裝有比例電動(dòng)開關(guān)風(fēng)閥，并與對(duì)應(yīng)的空調(diào)機(jī)組風(fēng)機(jī)連鎖，當(dāng)風(fēng)機(jī)關(guān)閉時(shí)，連鎖關(guān)閉電動(dòng)風(fēng)閥。所有風(fēng)閥均選用低泄漏風(fēng)閥；所有儀器儀表在布局、管線開孔以及施工完成后都對(duì)孔隙進(jìn)行密封處理。

1.2 電路系統(tǒng)

除空調(diào)設(shè)備單獨(dú)走動(dòng)力線外，房間內(nèi)的電路系統(tǒng)均從緩沖更衣室內(nèi)的UPS電源輸出，以保證電壓穩(wěn)定和停電后的短暫供電，保護(hù)儀器設(shè)備的良好運(yùn)行和斷電后實(shí)驗(yàn)的及時(shí)處理。培養(yǎng)室內(nèi)電線敷設(shè)均從玻美中空彩鋼板內(nèi)走線，保證無死角，利于衛(wèi)生的打掃。照明燈具均采用不銹鋼吸頂式潔凈熒光燈，在緩沖走廊及門口均安裝消防疏散指示燈。

1.3 氣路系統(tǒng)(CO2管道)

CO2氣瓶統(tǒng)一放在緩沖更衣室內(nèi)更衣柜旁的氣瓶柜內(nèi)，通過316L不銹鋼管道把氣體輸送到各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)房。鋼瓶減壓采用半自動(dòng)切換系統(tǒng)。氣路在主管道上設(shè)置自動(dòng)切換系統(tǒng)，左右兩瓶氣體能自動(dòng)切換保證不間斷供氣。管道與管道連接均采用軌道自動(dòng)焊接方式，焊接時(shí)采用管內(nèi)外充高純氬氣；閥門、減壓器與管道連接采用不銹鋼雙卡套方式，方便拆卸。

1.4 自控系統(tǒng)

所有細(xì)胞間的溫濕度、送回風(fēng)量、室內(nèi)壓力、消毒時(shí)間等的設(shè)定，均通過緩沖更衣室門口的觸摸控制屏來操作。該觸摸屏采用密碼登錄方式，需要輸入密碼才能對(duì)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，以方便管理。消毒系統(tǒng)采用臭氧密閉空間循環(huán)消毒[5]，臭氧發(fā)生器安裝在風(fēng)機(jī)口端，通過自控系統(tǒng)來設(shè)定消毒時(shí)間。消毒完成后消毒排風(fēng)機(jī)啟動(dòng)，排出室內(nèi)臭氧氣體。

1.5 儀器設(shè)備的放置

考慮到研究所儀器設(shè)備的具體情況，本培養(yǎng)室設(shè)計(jì)了4個(gè)儀器操作間。儀器室1用于放置不同規(guī)格的離心機(jī)；儀器室2用于放置活細(xì)胞工作站(徠卡，DMI6000B)；儀器室3用于放置熒光倒置顯微鏡(徠卡，DMI4000B)；儀器室4用于放置常規(guī)的熒光倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等常用設(shè)備。流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse)由于不具有分選功能，同時(shí)為兼顧其他實(shí)驗(yàn)的需求，因此沒有放置在培養(yǎng)室內(nèi)。每個(gè)細(xì)胞間均放置至少一臺(tái)二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(生物安全柜)、長寬高為1.5m×0.8m×0.8m的全304不銹鋼臺(tái)架以及用于放置常用耗材的收納箱。在前處理消洗室放置了多臺(tái)冰箱、水浴鍋、生物安全柜、液氮罐等儀器設(shè)備。

2 細(xì)胞培養(yǎng)室的運(yùn)行與管理

細(xì)胞培養(yǎng)室除需要好的硬件條件外，還需要有嚴(yán)格的管理制度。培養(yǎng)室的自控系統(tǒng)由專職教師負(fù)責(zé)管理[6-7]，系統(tǒng)每天7：00開放，20：00關(guān)閉，溫度保持為22℃。培養(yǎng)室還制訂了一系列相應(yīng)的管理制度，主要包括細(xì)胞培養(yǎng)室使用制度、儀器設(shè)備使用制度、液氮罐使用及細(xì)胞凍存制度等[7-10]。

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)室使用制度

1)每個(gè)進(jìn)出細(xì)胞室的工作人員必須登記進(jìn)出時(shí)間、使用細(xì)胞間號(hào)、使用儀器設(shè)備以及所做實(shí)驗(yàn)；

2)進(jìn)入培養(yǎng)室，必須更換潔凈的工作服和拖鞋；

3)進(jìn)入細(xì)胞間操作完畢后，必須進(jìn)行臺(tái)面清潔，用過的器皿、雜物、廢液等必須清理并帶出培養(yǎng)室；

4)每周一次全面的衛(wèi)生清理，包括地面、培養(yǎng)箱、桌面等，清理完畢后由專職老師負(fù)責(zé)臭氧消毒處理。

2.2 儀器設(shè)備使用制度

1)使用培養(yǎng)室內(nèi)的任何儀器設(shè)備時(shí)，如出現(xiàn)故障需及時(shí)告知負(fù)責(zé)老師；

2)使用二氧化碳培養(yǎng)箱時(shí)，需每天觀察二氧化碳?jí)毫Ρ?，如出現(xiàn)壓力低需及時(shí)告知負(fù)責(zé)老師更換氣瓶；

3)細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱相應(yīng)的劃分區(qū)域，未經(jīng)許可不許動(dòng)他人放置的細(xì)胞；

4)拿取冰箱內(nèi)樣品時(shí)動(dòng)作必須快，并及時(shí)關(guān)閉冰箱門；

5)活細(xì)胞工作站和熒光倒置顯微鏡必須在專責(zé)教師指導(dǎo)下進(jìn)行操作；

6)二氧化碳培養(yǎng)箱的參數(shù)不能隨意更改，如需更改則由負(fù)責(zé)教師進(jìn)行。

2.3 液氮罐的使用及細(xì)胞凍存制度

1)由專責(zé)教師負(fù)責(zé)定期查看液氮的容量并訂購，隨時(shí)保證有一罐液氮備用；

2)存放細(xì)胞時(shí)要根據(jù)細(xì)胞種類放置，同時(shí)一定要在存放記錄本上登記放入的位置、時(shí)間、細(xì)胞種類、數(shù)量、存放人等信息；

3)存取細(xì)胞時(shí)一定要注意安全，防止凍存管爆炸；

4)未經(jīng)他人同意，請(qǐng)勿隨意翻動(dòng)他人細(xì)胞凍存樣。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的交流

細(xì)胞培養(yǎng)從技術(shù)本身來講是一項(xiàng)通用的技術(shù)平臺(tái)，但針對(duì)各個(gè)研究課題(方向)而言，每個(gè)研究人員進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的目的和要求各不相同，既有共性又有特殊性。本文的細(xì)胞培養(yǎng)室僅供研究所師生使用，因?yàn)樯婕?個(gè)研究方向(家禽、水生動(dòng)物、反芻、飼料、母豬和育肥豬)，所以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)也大不相同。培養(yǎng)室針對(duì)這一情況建立了技術(shù)檔案制度，由專人管理，不同方向的研究人員探索的新技術(shù)，如細(xì)胞基因的敲除、細(xì)胞基因的超表達(dá)、不同來源及類型的原代細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定、細(xì)胞的免疫熒光分析等技術(shù)，不會(huì)因人走而流失，可以極大地豐富和積累特殊技術(shù)，提高技術(shù)水平，從而為后來者提供更多的方便[10]。

2.5 收費(fèi)制度

細(xì)胞培養(yǎng)室面積不大，但每年的維護(hù)成本卻不低，主要來源于初、中、高效空氣過濾膜的更換、二氧化碳的消耗、中央空調(diào)等儀器設(shè)備的維護(hù)和維修等。為了更好地運(yùn)行和管理培養(yǎng)室，研究所制定了一套收費(fèi)制度[11-12]。師生進(jìn)入細(xì)胞間，需提前申請(qǐng)并領(lǐng)用相應(yīng)培養(yǎng)間的鑰匙，實(shí)驗(yàn)做完后需及時(shí)歸還，按借還鑰匙時(shí)間來計(jì)算費(fèi)用。具體標(biāo)準(zhǔn)為每個(gè)細(xì)胞間按20元/天計(jì)算，如果多人共用一間培養(yǎng)房則平攤費(fèi)用。

3 結(jié)束語

本培養(yǎng)室在投入使用以來，也出現(xiàn)了不少的問題，特別是在建設(shè)時(shí)由于經(jīng)費(fèi)有限，只設(shè)計(jì)安裝了一臺(tái)空調(diào)設(shè)備，當(dāng)其發(fā)生故障不工作時(shí)，培養(yǎng)室的溫度無法調(diào)控。因此，建議其他實(shí)驗(yàn)室在經(jīng)費(fèi)充裕的情況下設(shè)計(jì)兩套空調(diào)系統(tǒng)。本培養(yǎng)室的隔斷全為手工玻鎂板，在外面看不到房間內(nèi)情況，建議其他實(shí)驗(yàn)室在設(shè)計(jì)時(shí)可設(shè)計(jì)部分潔凈玻璃窗或者設(shè)計(jì)安裝一套監(jiān)控系統(tǒng)。四川的空氣質(zhì)量較差，新風(fēng)口處的濾網(wǎng)會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)變臟，建議其他實(shí)驗(yàn)室在設(shè)計(jì)新風(fēng)過濾網(wǎng)時(shí)可設(shè)計(jì)一個(gè)多級(jí)多層濾網(wǎng)。

總之，隨著現(xiàn)代科學(xué)研究技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)室的要求也不斷提高，其管理也需要逐步加強(qiáng)。如何建設(shè)和管理好適應(yīng)高等院?？蒲幸蟮募?xì)胞培養(yǎng)室以促進(jìn)科研水平的提升是值得探討的課題。在新細(xì)胞培養(yǎng)房的設(shè)計(jì)和建設(shè)時(shí)，同行間應(yīng)相互學(xué)習(xí)并組織專家進(jìn)行論證，盡量減少問題的重復(fù)出現(xiàn)，從而讓新細(xì)胞培養(yǎng)房的建設(shè)更加科學(xué)與合理。