周曉霞，王自平 ，成述儒*

(甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730030；2.甘肅省隴西縣菜子畜牧技術服務站，定西 748100）

0 引言

超數(shù)排卵與胚胎移植技術（EMOT）是指對生產性能優(yōu)良和遺傳性穩(wěn)定的供體母畜進行外源激素超數(shù)排卵處理，使母畜排出比自然狀態(tài)下多幾倍甚至十幾倍的卵子，配種后一定時間內將受精卵取出，分別移植到其他母畜受體子宮內，使之產出優(yōu)良后代的技術[1]。

超數(shù)排卵與胚胎移植技術可最大限度地發(fā)揮優(yōu)秀種畜的利用價值，加速動物品種改良和育種速度。規(guī)?；B(yǎng)羊是我國羊產業(yè)發(fā)展的必然途徑 。人工輸精、超數(shù)排卵和胚胎移植技術是發(fā)展規(guī)?；B(yǎng)殖的重要措施，同期發(fā)情技術是人工輸精，胚胎移植技術的前提條件[2]。但在品種引進中會遇到一些問題，制約著畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。甘肅省被認為是西北的主要的牛羊肉生產基地和供應基地。隴西縣是甘肅省的肉羊大縣之一，為了快速擴大優(yōu)質種畜的數(shù)量，滿足全縣畜牧業(yè)發(fā)展的強勁的需求，在甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院等部門的支持下，在隴西縣進行了奶牛冷凍胚胎移植和綿羊新鮮胚胎移植的試驗和推廣，取得了可喜的成績。

盡管綿羊的冷凍胚胎已經市場化，但冷凍對胚胎畢竟會造成一定的傷害，在有條件的情況下，新鮮胚胎移植還是最佳的選擇。牛的非手術胚胎移植法已經在全國廣泛應用，而綿羊的非手術胚胎移植法還需要解決一些實際問題，目前腹腔鏡微創(chuàng)手術法是唯一可以推廣的可行的方法?，F(xiàn)將綿羊超數(shù)排卵與胚胎移植技術敘述如下，希望能夠與同行交流學習。

1 種公羊和供、受體母羊的選擇及飼養(yǎng)管理

種公羊與供體羊之比在1:4為宜。供體綿羊和受體綿羊之比在1:5為宜。

1.1 種公羊的選擇

選擇檢疫合格和有譜系的優(yōu)秀種羊。

1.2 優(yōu)秀供體綿羊的選擇

選擇遺傳性能穩(wěn)定、生產性能高、抗病力強、發(fā)情周期正常、無生殖道疾病，有1～2胎正常繁殖史的2～5歲的青壯年純種母羊作為供體。

1.3 受體母羊的選擇

選擇體格大、母性強、無婦科疾病、有正常繁殖史母羊作為供體。

1.4 飼養(yǎng)管理技術

提前驅蟲、健胃和注射疫苗。需要有中上等膘情。避免產生應激反應。

2 供體的超排及配種和受體的同期發(fā)情

綿羊的平均發(fā)情周期為17 d。做胚胎移植的最佳的季節(jié)是秋季。合理使用最佳的藥品，按羊的體格大小準確掌握使用計量。FSH總劑量150～300 IU，LH總劑量100～150 IU，PG0.08～0.1 mg只／次，CIDR是商品化的孕激素T型硅膠陰道栓劑，按說明書使用。

2.1 供體羊的超數(shù)排卵和配種

綿羊超數(shù)排卵常見方法有FSH＋PG法和孕激素（CIDR）＋FSH＋PG法等。下面主要介紹孕激素（CIDR）＋FSH＋PG＋LH法，這種方法模擬了自然周期過程，可提高采胚率和妊娠率。綿羊放入CIDR之日作為0 d，在第9 d換1個CIDR，在第13 d開始3 d 6次遞減注射FSH，每次間隔12 h，在第15 d早晚同時注射FSH和PG，第5注射FSH時撤去第2個CIDR栓，在第16 d或第17 d確定供體羊發(fā)情時立即注射LH。用結扎輸卵管了的試情公羊試情，觀察并做記錄。采用本交和人工授精相互交替的方式進行配種，每隔6h配1次。同時做好記錄。

2.2 受體羊的同期發(fā)情

目前綿羊的同期發(fā)情的方法主要采用孕酮陰道栓法和PG法。受體綿羊和供體綿羊同1 d放入CIDR之日作為0 d，在第9 d換1個CIDR，在第15天早晚各注射一次PG，第15天早上取出第二個CIDR，第16 d 注射LH。觀察并記錄發(fā)情情況。

3 胚胎的采集和移植

3.1 胚胎的采集

3.1.1 手術時間及術前準備

輸卵管-子宮角雙沖法綿羊的手術采集胚胎的時間：以發(fā)情配種日為0 d ，在5～7 d從輸卵管-子宮角采集胚胎。在5～7 d采用此法可以把在輸卵管和子宮角的胚胎盡可能的全沖洗出來，可以得到最多的胚胎。

手術前禁食1d，限量飲水。常規(guī)消毒。將羊仰臥保定在自制可移動的手術臺上，對術部剪毛、清洗，用5%的碘酊消毒。

3.1.2 輸卵管-子宮角雙沖法綿羊的手術采集胚胎

調節(jié)手術臺:把手術臺根據(jù)術者的身高調節(jié)，讓羊前低后高位仰臥，不要超過45°，這樣可以降低腹內壓便于操作，太高會引起胃內容物流出，有可能引起異物性肺炎。

手術部位:手術部位選擇在乳房前和肚擠眼之間的腹中線上，乳房前2 cm處。

沖胚過程:鋪上創(chuàng)布，縱向切開4 cm左右皮膚，鈍性分離皮下結締組織和肌肉層，腹膜層用鑷子輕輕夾住提起，用手術刀劃開，盡量使其邊緣整齊，在整個過程中盡量不要讓出血，遇見血管用止血鉗止血再切開。術者用食指和中指把子宮角牽引創(chuàng)口外，快速觀察和數(shù)出左側卵巢上黃體數(shù)，用腸鉗同時夾住子宮角分叉處與輸卵管漏斗部和輸卵管的壺腹部的交界處，不要傷及卵巢。用杜氏磷酸緩沖液20～30 mL（水浴加熱到30℃）由輸卵管漏斗部向子宮角分叉處沖洗，用19～20號針頭在子宮角分叉處扎一個小孔，然后將8～10號沖胚管從此空導入子宮角，給沖胚管氣囊充氣2～5 mL，拔出沖胚管內芯。在輸卵管漏斗部和輸卵管的壺腹部的交界處用6～8號針頭扎入輸卵管，用50 mL注射器把20～30 mL（根據(jù)黃體數(shù)確定）把沖胚液注入，當輸卵管和子宮角充盈時，放慢注射速度，用直徑為180 mm的表面皿接收沖胚液，等到全流完?？焖侔驯砻婷笏腿肱咛z查室，迅速數(shù)出胚胎數(shù)，如果胚胎數(shù)與黃體數(shù)相差大就再沖一次。拔掉針頭和沖胚管，取掉腸鉗，輕輕按摩被腸鉗鉗的部位，促進其血液循環(huán)，便于恢復。用同樣的方法沖右側。

縫合:沖胚完畢后，用含有甲硝唑的25～30℃的生理鹽水沖洗干凈子宮和卵巢，復位于腹腔。然后迅速轉位于縫合位置由縫合技術人員按分層依次縫合，在縫合前在腹部倒入適量加了青霉素和鏈霉素的溫熱生理鹽水。縫腹膜和皮膚時一定要注意，腹膜縫不好引起腹疝，皮膚縫不好引起感染。縫皮膚的時候，針間距不要太大，0.5～1.0 cm左右為宜，線不要太緊，縫合完畢，把線頭和結全都整理在刀口的一側，把皮膚依次整理好，不要讓毛夾在皮膚之間，讓刀口外觀美麗平整，這樣有利于刀口愈合。

3.2 胚胎的檢查、鑒定和吸取

含有胚胎的沖胚液應置于30℃的無菌箱中，最好在箱內檢查，也可以在20～25℃的無菌操作室內檢查，用2～3臺立體顯微鏡同時檢查，這樣可以縮短對胚胎進行檢查和鑒定的時間。

在5～7 d的胚胎絕大多數(shù)是桑椹胚至擴張囊胚。對胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致、結構緊湊、分裂均勻、色調和透明度適中的一二級胚胎用吸胚器移入直徑為35 mm培養(yǎng)皿中，待移。把胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致、輪廓不清晰、色調變暗和變性細胞達30%～58%的三級胚胎用吸胚器移入另一個直徑為35 mm培養(yǎng)皿中，待移。一二級胚胎每只移1枚，三級胚胎每只移2枚。四級胚胎變性細胞占胚胎大部分不可用于移植廢棄。

吸取胚胎 用移植器依次吸一段保存液、一段空氣、一段含胚胎的保存液、一段空氣、一段保存液。

3.3 受體綿羊的胚胎移植

與供體羊一樣保定和消毒。手術部位不同，避開兩條乳靜脈在在乳房前兩厘米左右微創(chuàng)移胚，左右各一個手術創(chuàng)，通過腹腔鏡觀察，把有黃體的一側子宮角拉出，用尖端磨鈍的16號針頭在子宮角尖處扎個小孔，把裝有胚胎的移植器從此孔插入，伸向子宮角尖，輕輕推出即可，堅決不能回吸。移植完，與供體羊一樣處理。

4 術后的飼養(yǎng)管理和妊娠診斷

加強管理，不要突然改變飼喂方法，順其自然，不要引起應激反應。每天由飼養(yǎng)員在羊吃草時給傷口上噴碘酒消毒，不要強制抓羊。早期可以B超檢查是否妊娠，但這樣會引起應激反應，增加流產頭數(shù)。在實際的生產中以飼養(yǎng)員觀察是否發(fā)情為主，兩個情期不發(fā)情視為以懷孕。

5 改進思路與前景預測

子宮和子宮角在盆腔里具有可移動性。有一種自制的微創(chuàng)去勢手術刀，刀尖端有點像針灸針中的三棱針，稍微寬一點點，刀柄有一個半月牙很光滑的鉤鉤，可以往外挑子宮角，這種工具很好用，過去的老獸醫(yī)大夫常用，現(xiàn)在基本見不到了。這樣就避免了供體羊腹中線的手術部位，縮小了創(chuàng)傷面積，供體羊只需要一側有手術創(chuàng)，減少了一個手術創(chuàng)，并且不需要給腹腔打氣了，術后會減少術后粘連和感染的機會。

在術中不用腹腔鏡，腹腔鏡太貴了，畜牧技術人員只能在最低的成本下去推廣技術。在術部局麻處理后，切開2～4 cm切口，鈍性分離肌肉層，切開腹膜層，在切口的靠背側用拇指垂直于地面的方向用力一壓（要求術者拇指的力量可以撐起自己的重量），就像去勢一樣充分利用動物的腹壓，擠出卵巢，然后四指墊在下面，同時用手背壓腹壁，用拇指輕輕向懷里方向摸，兩側的卵巢、子宮角和子宮體都會暴露在術者面前，動作一定要輕而果斷，如果萬一卵巢擠不出來，只要術者輕輕深入中指或食指摸到子宮角或者卵巢貼著腹壁輕輕向外撫摸叫可以順利進行了，如果萬一術者手感差不能準確區(qū)分腸管和子宮角的區(qū)別，千萬不要在腹腔亂摸，避免造成不必要的傷害，這種情況下清洗外陰后，找一個末端鈍性光滑的圓棒棒，套上避孕套，慢慢插入生殖道，當?shù)竭_子宮頸的時候輕輕向手術部位方向頂，術者同時伸入手指去摸，既可以摸到子宮體、子宮角和卵巢，引出術口即可，我把這種迫不得已的方法稱為順藤摸瓜法，不要沖洗生殖道，因為生殖道有自凈功能，沖洗反而破壞了它的微環(huán)境。把子宮牽拉出體外后，關閉創(chuàng)口，上蓋用溫熱生理鹽水浸泡過的敷料，將子宮、子宮角和卵巢放于敷料上。

通過腹腔鏡速度快，但手術部位肌肉也被切斷，并且兩側都有創(chuàng)口口，增加了感染的機會。這樣采胚胎或者輸胚胎對羊的傷害比去勢的傷害程度還要小，推廣就更容易了。這樣就大大降低了新鮮胚胎移植的成本，把一個復雜的事變得更簡單了，才有利于它產業(yè)化。

通過腹腔鏡速度快，但手術部位肌肉也被切斷，并且兩側都有創(chuàng)口，增加了感染的機會。這樣采胚胎或者輸胚胎對羊的傷害比去勢的傷害程度還要小，推廣就更容易了。這樣就大大降低了新鮮胚胎移植的成本，把一個復雜的事變得更簡單了，才有利于它產業(yè)化。

我們可以在人醫(yī)中去學習，將羊的無痛非手術法胚胎移植變成現(xiàn)實是我們技術人員需要解決的實際問題。

總之，胚胎移植技術為純種擴繁最佳的手段，通過這種技術能夠讓非繁殖季節(jié)的誘導發(fā)情、超數(shù)排卵及鮮胚移植成為了現(xiàn)實[3]。新鮮胚胎和冷凍胚胎的移植必將會有機結合，像人工授精一樣會得到廣泛的應用，推動我國的畜牧產業(yè)的快速發(fā)展，增強國際競爭力。

參考文獻

[1] 朱化彬，王皓宇，杜衛(wèi)華，等.我國胚胎生物技術進展及其在良種牛擴繁中的應用[J].中國畜牧雜志，2014（2）:61-67.

[2] 包花拉，莫德日樂吐，王海軍，等.同期發(fā)情處理綿羊發(fā)情規(guī)律探討[J].畜牧與飼料科學，2015（11）:51-54+75.

[3] 王偉.綿羊的胚胎移植與高頻繁殖技術分析[J].北京農業(yè)，2015（35）:124-125.