梁 倩，于鳳麟，趙月萍

(1.暨南大學口腔醫(yī)學院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學細胞生物系/生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510632)

牙髓組織是包括有各種細胞，纖維，血管，神經(jīng)的一個完整的器官組織。當恒牙發(fā)育期間受到創(chuàng)傷、炎癥等引起牙髓感染壞死時，會使牙根發(fā)育停止，此時患牙牙根短，冠根比例不協(xié)調(diào)，根部牙本質(zhì)壁薄弱易折裂等，在口內(nèi)的使用質(zhì)量和壽命都將受到影響 。傳統(tǒng)的治療方法是根尖誘導術(shù)，通過根尖屏障使根尖孔閉合。不過存在部分患牙牙根不能繼續(xù)發(fā)育，牙根短、根管牙本質(zhì)壁薄受力易折等不足，牙髓血運重建術(shù)(revascularization)可以彌補根尖誘導愈后的不足，并有可能再生牙髓-牙本質(zhì)復合體。

牙髓血運重建術(shù)有三大關(guān)鍵因素：控制感染 、形成血凝塊與封閉冠部。通過此三步操作形成了一個牙髓腔內(nèi)細胞賴以生存的環(huán)境，即“微環(huán)境”，直接影響到血運重建術(shù)的成功與否。如果發(fā)生根管再感染，或者血凝塊形成不足，牙髓微環(huán)境重建不善會導致血運重建術(shù)的失敗[1-2]。牙髓“微環(huán)境”，通俗的講就是指牙髓內(nèi)細胞生存的微觀環(huán)境，包括細胞外基質(zhì)以及其中的一些體液成分。只有穩(wěn)定的微環(huán)境才能保證細胞/干細胞的正常增殖、分化、代謝和功能活動。牙髓腔內(nèi)的多種細胞、神經(jīng)、血管，淋巴和結(jié)締組織共同組成了牙髓，其再生的能力取決于干細胞或祖細胞的潛能和微環(huán)境的影響。創(chuàng)傷或感染破壞牙髓組織微環(huán)境的平衡，干擾干細胞增殖分化，促進干細胞凋亡，最終導致牙根停止發(fā)育。血運重建術(shù)基于創(chuàng)造一個利于干細胞生存的無菌的微環(huán)境的理念，通過刺激根管內(nèi)出血形成血凝塊，利用干細胞歸巢作用誘導根尖周組織的干細胞進入根管，在生長因子和血凝塊等搭建的微環(huán)境內(nèi)使得干細胞增殖分化，促進組織新生，最終達到牙髓再生的目的。但是血運重建術(shù)只能得到類牙髓樣組織，沒有真正意義上的牙髓組織[3]。隨著生物技術(shù)發(fā)展和醫(yī)療手段的進步，血運重建術(shù)從引導組織再生(guided tissue regeneration,GTR)向采用組織工程(tissue engineering)技術(shù)發(fā)展，以期獲得具有完整組織功能的牙髓，這也是目前再生性牙髓治療(regenerative endodontics procedures，REPs)的發(fā)展方向和研究熱點。本文查閱了近10年血運重建術(shù)的報導，綜述了微環(huán)境在血運重建術(shù)中的重要作用，并對牙髓再生新技術(shù)進行了展望。

1 血運重建術(shù)的發(fā)展歷程

早在二十世紀六七十年代，Ostby首次利用血凝塊促進根管愈合[4]。他對牙髓壞死的年輕恒牙，用4%甲醛消毒，刺激根管出血，形成血凝塊，術(shù)后隨訪患牙的臨床癥狀消失，影像學檢查根尖孔閉合。1966年Rule和Winter考慮到根管內(nèi)感染為厭氧菌為主的混合感染，采用多聯(lián)抗生素(多粘菌素B硫酸鹽、硫酸新霉素、桿菌肽、制霉菌素)和可吸收的碘仿匯合控制根管感染，但不刺激根管出血，文章報導了5個案例，只有1例牙根繼續(xù)發(fā)育，有4例沒有成功。1996年Hoshino首次提出采用三聯(lián)抗生素(triple antibiotic paste，TAP)來控制根管感染，通過藥敏試驗和細菌復蘇實驗，對不同濃度TAP的抗菌性能進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAP在20 μg/ml、50 μg/ml時，細菌數(shù)目為零。2000年Iaway 報道了現(xiàn)代血運重建的病例，對于牙髓壞死的年輕恒牙不預備根管，僅用大量5%NaClO和3%H2O2沖洗根管，然后根管內(nèi)封兩聯(lián)抗生素(double antibiotic paste，DAP)來控制感染，6周后發(fā)現(xiàn)根管口有牙本質(zhì)橋的形成。隨后用玻璃離子和樹脂雙層充填。30個月后的隨訪顯示髓室和根管的空間減小，治療獲得成功。此后血運重建操作不斷完善和規(guī)范，2001年至今pubmed輸入“pulp revascularization”檢索有212篇文獻報道，表明血運重建得到了廣泛的認可和應用。2013年學者Diogenes首次提出了標準操作流程，經(jīng)過臨床不斷探索 修正和完善，美國牙髓病協(xié)會(American Association of Endodontics,AAE)于2013年發(fā)布了完整的操作指南，目前最新為2016年版。

血運重建為牙髓壞死的年輕恒牙提供了新的治療思路，大量的動物和人類研究證實它使得牙根繼續(xù)發(fā)育，牙根增加長度和根管壁增加厚度，相比較于根尖誘導和根尖屏障術(shù)來說，是目前最好的治療手段，但是它也有失敗的案例，比如血凝塊形成不足導致的失敗，術(shù)后根尖未繼續(xù)發(fā)育等問題[1，2，5]。因此如何提高血運重建的成功率是我們亟待解決的問題。

2 無菌的微環(huán)境和組織再生

血運重建術(shù)簡單分為以下三個操作：①清理感染牙髓：不預備根管，大量有效的根管沖洗，干燥后根管封抗菌藥物，然后冠部封閉；②檢查患牙無癥狀，用小號銼超出根尖孔，刺激根尖周血液進入根管，然后冠部嚴密封閉，以防微滲漏；③隨訪及預后評估，其中的感染控制和冠部封閉為牙髓腔創(chuàng)造了一個無菌的微環(huán)境。

組織再生必須是在感染控制下的微環(huán)境內(nèi)才能發(fā)生，因此對于牙根未發(fā)育完全的年輕恒牙，感染控制和冠部的封閉非常有必要。未發(fā)育完成的年輕恒牙主要通過化學消毒和根管封藥來控制感染，不建議根管預備，因為預備根管不僅會繼續(xù)削弱薄的牙本質(zhì)壁，增大受力根折的風險；還會破壞存在于根尖區(qū)的干細胞，清除掉參與再生過程中分泌重要的生長因子的組織成分[6]。根管常用的沖洗液是次氯酸鈉和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，TAP/DAP和氫氧化鈣(calcium hvdmxide，CH)是根管內(nèi)常用封藥。

次氯酸鈉是目前臨床使用最多的一種根管沖洗劑，能夠較強地溶解牙髓壞死組織和根管玷污層中的有機物，推薦的使用濃度從0.50%～5.25%不等，其濃度與細胞毒性正相關(guān)。Asrary體外研究不同濃度次氯酸鈉過牙髓細胞活性的研究發(fā)現(xiàn)當次氯酸鈉的濃度由0.04%上升至0.08%，細胞活性下降30倍，因此他認為高濃度的次氯酸鈉對干細胞有細胞毒性[7]。另一對1.25%次氯酸鈉沖洗液和TAP的研究發(fā)現(xiàn)，僅用1.25%次氯酸鈉沖洗根管只有10%的根管無菌，而根管封藥TAP兩周后，剩余90%的根管里細菌為0[8]。這說明了根管內(nèi)起到抗菌主要作用的是TAP，因此在考慮盡可能地保持干細胞的活性情況下，可以選擇低濃度的次氯酸鈉大量的沖洗。

EDTA是一種強效螯合劑，可與次氯酸鈉溶液聯(lián)合使用。17%的EDTA沖洗劑不僅可以去除牙本質(zhì)中的有機物和無機物，以及牙髓組織中的部分無機物成分，還可清除牙本質(zhì)玷污層并開放牙本質(zhì)小管，提高沖洗劑及根管內(nèi)封藥的療效，還可以使促進細胞募集，增殖分化的細胞釋放細胞因子，提高再生治療的成功率[9-11]。Asgary研究證實5.25%次氯酸鈉對干細胞有毒性，但是17%EDTA可以起到誘導干細胞存活的作用[7]。Galler研究了次氯酸鈉和EDTA對牙本質(zhì)小管的作用，實驗分兩組，一組只用6%的次氯酸鈉清理牙本質(zhì)，一組6%的次氯酸鈉和17%EDTA聯(lián)合使用。DPSC接種到含有生長因子和處理過的牙本質(zhì)壁的水凝膠，植入免疫缺陷鼠的皮下，六周后免疫組化結(jié)果示：單獨次氯酸鈉組牙本質(zhì)璧上可見吸收間隙，而聯(lián)合組可見細胞表面與牙本質(zhì)壁親密接觸，細胞突起延伸至牙本質(zhì)小管內(nèi)和牙本質(zhì)細胞樣表型表達[12]，說明了17%EDTA可以逆轉(zhuǎn)次氯酸鈉對干細胞的毒性作用。

根管封藥以控制感染但不損傷干細胞活性為目的，常用的藥物是TAP/DAP或CH。Sabrah體外實驗研究了不同濃度TAP和DAP的抗菌性和細胞毒性作用，分別對糞腸球菌建立的細菌生物膜和牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)處理3 d，結(jié)果顯示TAP、DAP在濃度為10、1、0.5、0.25、0.125 mg/ml時，均有抗菌作用，但只在0.125 mg/ml對DPSC無細胞毒性作用[13]。AAE推薦的使用濃度為0.01～0.1 mg/ml[14]。CH同樣是根管封藥選擇之一。2012年Chen研究20例牙髓壞死的年輕恒牙封藥CH血運重建的效果，其中平均隨訪時間19.6月內(nèi)15例患牙影像學顯示牙根得到進一步發(fā)育，證實氫氧化鈣對根尖乳頭干細胞無毒性。2015年 Galler KM[10，12]報道指出EDTA沖洗根管后再使用CH對生長因子的釋放起到積極作用。

但是，TAP或CH也各有不足，研究證實米諾環(huán)素引起牙體變色，可用阿莫西林、克林霉素等替代。TAP還存在對干細胞的毒性[10]、誘導耐藥菌株產(chǎn)生、發(fā)生過敏反應等和降低牙本質(zhì)機械性能等不足[15]。學者研究CH易被炎癥吸收、形成不規(guī)則鈣橋和破壞牙本質(zhì)膠原纖維易引起根折等缺點[16]。

冠部封閉常采用雙層或者三層封閉，以防微滲漏引起根管再感染造成治療失敗[17]。常選擇生物相容性好的材料如三氧化物聚合體(mineral?trioxide?aggregate，MTA)覆蓋血凝塊上。鑒于MTA會引起牙變色，新一代的生物陶瓷材料，主要成分包括氧化鋯、氧化鉭、磷酸二鈣、硅酸鈣等，可以完善封閉根管系統(tǒng)與其周圍組織的交通支，與周圍組織相容性好適用范圍與MTA 相同。

由上可見，不同種類和不同濃度的沖洗試劑和抗生素可以控制感染，為細胞營造一個無菌的環(huán)境外，還可以影響干細胞/細胞的活性。此外在感染環(huán)境下牙髓腔內(nèi)還會有產(chǎn)生系列的炎癥因子。

最近的證據(jù)表明[18]，感染對于組織創(chuàng)傷修復是把雙刃劍，炎性反應初期刺激受損組織釋放信號因子，使大量干細胞聚集在受損部位，促進組織自我修復；隨著炎性反應的發(fā)展，組織再生受到限制。在牙髓炎早期，炎性反應水平低，細胞因子處于相對低的濃度水平，該濃度下的促炎因子如腫瘤壞死因子(tumor necyosis factor，TNF)、活性氧類(reactiveoxygen species，ROS)，能上調(diào)某些信號通路如P38MAPK 信號，促進干細胞分化和礦化過程，以及牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphor protein，DPP)的表達[19]，隨著炎癥的發(fā)展，干細胞長期暴露于炎癥信號分子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，破壞了干細胞的微環(huán)境，干擾干細胞增殖、分化能力，甚至引起干細胞凋亡，導致牙根的發(fā)育停止[3]。

3 根管內(nèi)微環(huán)境與血凝塊

當患者第二次復診，患者癥狀消失，生理鹽水去除根管抗生素封藥，17%EDTA蕩洗根管，紙尖干燥。選擇10號K銼出根尖孔，刺激根尖周組織出血，使血液進入充滿根管至釉牙骨質(zhì)界下3～4 mm,血凝塊凝固需要15 min。

2015年，Park報道兩例血運重建不成功的病例：①病例一：患者男，8歲，診斷右下頜第二前磨牙牙髓壞死伴根尖周膿腫，根尖片示：根尖孔開放，根尖周有較大的低密度影?？紤]根尖孔開放，經(jīng)患者及家屬知情同意，對患牙做血運重建。首診2%的利多卡因(含1∶100,000腎上腺素)局部麻醉，橡皮障隔離，5.25%次氯酸鈉沖洗和生理鹽水沖洗根管，封TAP(甲硝唑+環(huán)丙沙星+阿莫西林1∶1∶1生理鹽水調(diào)拌)Cavit暫封。三周后復診，患牙無癥狀，去封，生理鹽水沖洗，17%EDTA蕩洗根管。紙尖干燥，10號K銼出根尖孔刺激出血，MTA封閉，放置濕潤的小棉球，暫封，1 d后取出棉球，復合樹脂充填。隨訪1年觀察：患牙無癥狀，根尖周陰影消失，根尖孔閉合，可見牙周膜間隙。但是未見牙根繼續(xù)發(fā)育。②病例二：患者女，20歲，右下頜第二前磨牙診斷牙髓壞死的根尖周膿腫，根尖片檢查根尖孔開放，根尖周低密度影。處理同上，1年后隨訪檢查根尖孔關(guān)閉，可見牙周膜間隙，但是牙根未見增長，根管壁未見增厚。

上述病例一失敗原因可能是形成血凝塊不穩(wěn)定，MTA擠壓血凝塊過多根管空間，根管內(nèi)血凝塊的不足限制了牙根的進一步發(fā)育。病例二的原因是根尖孔的直徑小血凝塊形成不足。由上述案例報導可見血凝塊的形成及性狀在血運重建術(shù)中起到了非常重要的作用。血凝塊實際上是一個含有大量生長因子、吸引干細胞募集的三維支架，維持了干細胞增殖、生長和分化所需要的微環(huán)境，對牙髓再生意義重大。

血凝塊的形成與兩個因素有關(guān)，一個是要選擇不含腎上腺素局部麻醉藥物，另一個是患牙根尖直徑至少>1.1 mm或1.5 mm[20-21]，根管口>3.2 mm[22]或<0.8 mm[23]無法得到足夠并穩(wěn)定的血凝塊。在血凝塊上放置膠原水凝膠等可以幫助固定血凝塊。Jang研究了膠原膜對寬大根管血運重建的作用，將46個根尖孔均>2 mm的患牙分為兩組，試驗組在根中1/3處血凝塊上放置Bio-Gide膠原膜，其上再放MTA，對照組只在根中1/3血凝塊上放MTA。平均隨訪時間8～28個月，發(fā)現(xiàn)放置膠原膜的根中1/3牙本質(zhì)壁的厚度有統(tǒng)計學差異，表明膠原膜穩(wěn)定了寬大根管血凝塊的定位，促進牙本質(zhì)的發(fā)育[24]。

血凝塊形成后，誘導了根尖周血管內(nèi)干細胞向血凝塊遷移，并募集在血凝塊周圍，此現(xiàn)象被稱為干細胞歸巢(stem cells homing)。這些募集的機體自身干細胞都不同程度地參與了創(chuàng)傷愈合和組織再生的過程。血凝塊也可以認為是一個干細胞龕(stem cell niche)，包含有各種復雜成分如其他的干細胞、基質(zhì)細胞、免疫細胞、生長因子、黏附因子等其他活性因子、細胞外基質(zhì)和神經(jīng)纖維等。2011年Lovelace等發(fā)現(xiàn)刺激出血后根管內(nèi)有CD105、CD13、STRO-1高表達的干細胞，他們認為這些干細胞來自于根尖周組織，進入根管的血液中干細胞的含量是根尖周血液的700倍[25]。研究發(fā)現(xiàn)位于根尖周血管周圍的干細胞有：根尖乳頭干細胞(stem cells form the apical papilla,SCAP)，牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs))，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)，還有根管殘髓里的DPSCs。Hargreaves證實進入根管的干細胞主要是SCAP[26]，不過因為根尖孔敞開的解剖結(jié)構(gòu)，也有PDLSCs和BMMSCs[26]進入根管。另外動物實驗證實即使牙髓壞死的根尖周病變，根管內(nèi)也還有部分牙髓有活力，這些組織中含有的DPSCs血運重建后繼續(xù)存在根管內(nèi)，易被誤為真正的牙髓再生[27]。

干細胞的分化與所處的微環(huán)境密切相關(guān)。如果干細胞離開了特定的龕，其生物學行為將由新的微環(huán)境改變。因此干細胞的分化與所處的微環(huán)境密切相關(guān)。血凝塊形成后，含有大量的生長因子，如血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。它在創(chuàng)傷修復的早期可以促進血管愈合并招募干細胞促進其增殖，但不參與干細胞的分化[28]；PDGF可以促進根尖牙乳頭干細胞的增殖，同時能促進細胞外基質(zhì)的表達，還能提高細胞耐受凋亡的能力，PDGF還可以促進體外培養(yǎng)的牙乳頭干細胞增殖，抑制其堿性磷酸酶(alkline phosphatase，ALP)的活性，即PDGF可能參與調(diào)節(jié)根尖牙乳頭干細胞向成牙本質(zhì)細胞的分化。另一方面牙本質(zhì)基質(zhì)也釋放了大量的生長因子：如轉(zhuǎn)化生長因子beta 1(transforming growth factor beta 1,TGF-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP - 2)或成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，β-FGF)[29-30]。 這些因子是間充質(zhì)干細胞向牙本質(zhì)細胞分化參與牙本質(zhì)形成的重要調(diào)控因子。其中BMP-2可以調(diào)節(jié)干細胞的牙源性分化，促進新生基質(zhì)的礦化。VEGF對SCAP或DPSCs牙源性分化能力起協(xié)同作用[31]。對牙本質(zhì)壁表面進行清理，可促進牙本質(zhì)基質(zhì)中生長因子的釋放[32]。

大多數(shù)的動物和人類實驗強調(diào)了血凝塊的重要性是因為血凝塊里含有的細胞基質(zhì)、纖維蛋白、趨化因子和生長因子等，共同構(gòu)建了一個干細胞向牙髓樣組織分化的微環(huán)境。 因此血運重建能否創(chuàng)建一個有益于干細胞分化成牙髓樣組織的微環(huán)境是血運重建術(shù)成功的重要影響因素。但遺憾的是目前大量的組織學研究證明新生的組織主要是類骨樣，類牙骨質(zhì)樣或類牙周樣組織，沒有明確的研究顯示形成了類牙髓組織[27，33]。

為得到完整組織結(jié)構(gòu)和功能性的牙髓組織，組織工程技術(shù)被引進到牙髓再生領域。搭載或未搭載有干細胞/細胞的三維支架材料，復合或未復合生長因子和趨化因子，被植入到牙髓腔內(nèi)誘導牙髓組織的形成。目前支架材料分來天然材料、人工合成材料和復合材料。天然材料如血小板富集血漿(PRP)、膠原、殼聚糖、血凝塊等，它們具有良好的生物相容性和生物降解性。Bezgin研究發(fā)現(xiàn)，濃縮血小板豐富的血漿 (cPRP)在治療根尖病變和開放性頂點時有重要作用[34]。在臨床實際操作中，還存在根管無出血的情況，在沒有血凝塊形成的情況下可用富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)或富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)代替血凝塊，也能達到同樣的治療效果[35]。Bezgi報道了使用富集血小板血漿(platelet-rich plasma，cPRP)治療牙髓壞死的未成熟牙齒治療的兩個病例，12月后隨訪患者無癥狀，影像學顯示牙根進一步發(fā)育，作者認為cPRP用于成功治療牙根未發(fā)育完成的根尖病變的血運重建的支架材料[36]。另有病例報道指出，PRP支架的治療可以改善和加速未發(fā)育完成的牙根的進一步發(fā)育[37]。目前很多病例報道和動物實驗研究PRP和PRF代替血凝塊支架，Mittal[37]認為兩者支架都可以加速組織的新生，Narang[38]研究認為PRF在根尖孔閉合和增加根長和根管壁厚度方面較PRP和血凝塊好。人工合成支架主要是丙交酯乙交酯共聚物，如聚乙交酯、聚L-丙交酯或兩者的共聚物。常用的還有羥磷灰石-磷酸三鈣和釉基質(zhì)蛋白。

生長因子則誘導促進干細胞增殖和分化。大多數(shù)生長因子通用并可刺激干細胞分化，部分具有特異性，專門幫助誘導分化某些特定的細胞類型。牙本質(zhì)牙髓再生研究涉及的生長因子主要有TGF、BMP、VEGF、FGF和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白等。干細胞根據(jù)其來源分為牙源性和非牙源性。牙源性干細胞主要有以下五種：DPSCs、SCAP、牙胚細胞(germ cell)、乳牙干細胞(stem cell form human exfoliated deciduous teeth,SHED)和牙囊干細胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs),其中牙髓干細胞最為關(guān)注，研究證實SCAP更適合用于以細胞為基礎的牙髓再生，尤其是進行以再生牙根為目的的牙髓再生。將體外擴大培養(yǎng)的DPSCs、SHED和SCAP通過支架分別植入大鼠皮下和豬的牙槽窩中，有牙本質(zhì)牙髓復合物(dentin-pulp?complex，DPC)形成[39-40]；非牙源性干細胞主要有BMMSC、胚胎干細胞(embryonic stem cell)、神經(jīng)嵴干細胞(neural crest stem cell)和毛囊干細胞(hair follicle stem cell)等，研究證實骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪來源的間充質(zhì)干細胞也能形成牙髓樣組織[41]。

然而目前組織工程技術(shù)還只是處在研究發(fā)展階段，雖有眾多的生物材料可供選擇，但均未有牙髓牙本質(zhì)復合體再生，距功能性牙髓再生還有很長的路要走。

血運重建在一定程度上解決了當下臨床問題，延長患牙的使用壽命，然而仍缺少大規(guī)模的臨床研究數(shù)據(jù)，并且組織學牙髓再生沒有真正實現(xiàn)，組織工程的引入為牙髓再生治療提供新的思路，目前研究較多的有3D打印、細胞膜片等技術(shù)，但干細胞的來源、儲存問題，適宜支架材料的選擇，生物工程微環(huán)境的構(gòu)建等一系列問題給我們帶來了很大的挑戰(zhàn)，因此需要多學科共同協(xié)同發(fā)展，以期創(chuàng)建干細胞牙髓樣分化的微環(huán)境，實現(xiàn)牙功能性牙髓的再生，為患者帶來真正的福音。

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