趙 暉

（遼寧省大連市普蘭店區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116200）

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中，常利用血凝和血凝抑制試驗(yàn)，對(duì)禽流感、新城疫等具有血凝性的病毒進(jìn)行鑒定或?qū)Πl(fā)病禽群進(jìn)行疫病診斷、對(duì)禽群的免疫狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)等。

1 定義與原理

1.1 血凝

某些病毒或病毒的血凝素，能選擇性的使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝。

1.2 血凝抑制

當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r(shí)，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯臃磻?yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。

2 血凝和血凝抑制試驗(yàn)的操作細(xì)節(jié)

自備器材、試劑；領(lǐng)取病毒抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；制備1%雞紅細(xì)胞；血凝試驗(yàn)，判定；4HAU回滴；稀釋抗原；血凝抑制試驗(yàn)；判定結(jié)果。

2.1 自備器材、試劑

96孔V型反應(yīng)板，微量移液器、阿氏液、pH7.2 0.01mol/L PBS液。

2.2 領(lǐng)取抗原

領(lǐng)取禽流感或新城疫抗原及相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。

2.3 1%雞紅血球的制備

取3只或3只以上SPF公雞或無(wú)禽流感和新城疫等病原感染的的健康公雞的血液與阿氏液等體積混勻，用PBS液（pH7.2、0.01mol/L）反復(fù)洗滌3次，每次以 2000轉(zhuǎn) /min（用于新城疫抗體檢測(cè))）或1000轉(zhuǎn)/min（用于禽流感抗體檢測(cè)）離心10min，洗滌后的紅血球與PBS液混合均勻，配置成1%的紅細(xì)胞懸液，置4℃冰箱冷藏。

2.4依據(jù)GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)、GB/T16550-2008新城疫診斷技術(shù)進(jìn)行血凝試驗(yàn)、4HAU回滴、稀釋抗原、血凝抑制試驗(yàn)的操作。

2.5 HI結(jié)果判定

以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。陰性對(duì)照孔血清滴度小于或等于2log2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清不超過(guò)1個(gè)滴度的誤差，作為實(shí)驗(yàn)成立的先決條件。以禽流感為例，HI≤3log2判定HI試驗(yàn)結(jié)果為陰性；HI價(jià)＝4log2試驗(yàn)結(jié)果為可疑，需要重復(fù)試驗(yàn)，HI≥5log2試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

3 血凝與血凝抑制試驗(yàn)注意事項(xiàng)

3.1 4HAU抗原最好現(xiàn)用現(xiàn)配制

3.2 抗原滴加的順序

每次向板內(nèi)滴加抗原時(shí)，移液器滴頭要與平面45度懸空，不要觸碰到孔內(nèi)的液體，由后向前依次滴加（即濃度由低往高滴加）。

3.3 抗原抗體反應(yīng)時(shí)間

抗原抗體在室溫20～25℃下，必須反應(yīng)30min以上，若環(huán)境溫度低于室溫，可將微量反應(yīng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中，使二者充分反應(yīng)。

3.4 磷酸鹽緩沖液的PH值

磷酸鹽緩沖液的pH值要在高壓滅菌后進(jìn)行滴定，往往在高壓后pH值會(huì)有所改變，所以高壓后再調(diào)一次pH值更為準(zhǔn)確。磷酸鹽緩沖液一經(jīng)使用保存期不要超過(guò)3周。當(dāng)pH＜5.8時(shí)，紅細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自凝現(xiàn)象；當(dāng)pH＞7.8時(shí)，圖形洗脫加快，易造成肉眼觀察產(chǎn)生誤差；pH＝7.2時(shí)，紅細(xì)胞沉降最充分，圖形最清晰。

3.5 采血雞的只數(shù)要求3只以上

將雞血放置于15mL離心管內(nèi)進(jìn)行洗滌，避免使用1.5～2mL離心管洗滌。

3.6滴加1%紅細(xì)胞懸液時(shí)，要經(jīng)?；蝿?dòng)紅細(xì)胞懸液，使紅細(xì)胞均勻分散在磷酸鹽緩沖液中，防止紅細(xì)胞下沉。

3.7 判定時(shí)間

加入雞紅血球之后，反應(yīng)板在室溫（20～25℃）靜置30～40min，對(duì)照孔血球下沉于孔底，即可判定結(jié)果。若室溫達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求，需相應(yīng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)環(huán)境溫度低于4℃時(shí)，紅細(xì)胞發(fā)生自凝；高于37℃時(shí)，會(huì)發(fā)生反應(yīng)物分離和紅細(xì)胞溶血。

3.8檢測(cè)禽流感抗體時(shí)，洗滌雞紅細(xì)胞離心轉(zhuǎn)數(shù)為：1000 RPM，離心10min；檢測(cè)新城疫抗體時(shí)，洗滌雞紅細(xì)胞離心轉(zhuǎn)數(shù)為：2000 RPM，離心10min；1000 RPM和2000 RPM離心轉(zhuǎn)數(shù)離心雞紅細(xì)胞壓積不一樣，導(dǎo)致1%雞紅細(xì)胞濃度不一樣，影響檢測(cè)結(jié)果。