劉成城，曾林祥

(南昌大學第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是多種肺部疾病的共同結(jié)局，其特征是的成纖維細胞(fibroblast，F(xiàn)B)增殖活化和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，導致正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞和肺功能持續(xù)下降，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是PF最常見的表現(xiàn)形式。肺纖維化是一種慢性進展的高病死率疾病，且目前缺乏有力的治療手段。過去一直認為ECM是一種惰性支撐結(jié)構(gòu)，并不參與PF的病理發(fā)展。而近來越來越多的證據(jù)表明，ECM在PF病程中的作用要比傳統(tǒng)所認為要復雜的多。本綜述將重點討論ECM的病理改變在PF發(fā)展中的重要作用，為研究PF的慢性長期和進行性加重特性提供了新思路并尋求新的可能的治療靶點。

1 PF中ECM的來源

肌成纖維細胞(myofibroblast，MF/FB)是一類活化了的FB，其增殖活躍并能夠分泌ECM蛋白，是ECM的主要來源。而PF中MF主要有3個來源: 原位肺織內(nèi)FB的轉(zhuǎn)化，氣道上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)，以及骨髓起源的循環(huán)內(nèi)纖維細胞(fibrocytes)的轉(zhuǎn)化[1]。FB活化是MF的主要來源，局部肺組織損傷時FB可分化為MF并分泌大量ECM。而EMT是指上皮細胞喪失自身部分細胞特征而向間質(zhì)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化并獲得一些間質(zhì)細胞特征。IPF患者和PF模型中均能觀察到肺泡上皮細胞通過EMT轉(zhuǎn)化為FB/MF，多種microRNAs(miRNAs)介導這一過程[2]。Fibrocytes是骨髓起源的循環(huán)內(nèi)的FB前體細胞，其細胞表面兼可表達單核細胞、造血細胞、成纖維細胞系的3種細胞標記。病理情況下fibrocytes能從循環(huán)中趨集到局部損傷部位并分化為MF分泌ECM[3]。MF分泌ECM在肺損傷修復過程中是不可缺少的，正常情況下?lián)p傷修復活躍期結(jié)束時MF會通過細胞凋亡逐漸降解。但肺處于長期慢性損傷或IPF等病理情況下，MF持續(xù)存在并引起ECM過度沉積，ECM發(fā)生病理性改變最終發(fā)展為肺纖維化。

2 PF中ECM的生物力學特性

各種ECM蛋白的過度沉積使其生物力學特性發(fā)生改變，其改變通過影響轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)活化推動PF發(fā)展。交聯(lián)酶同樣可以調(diào)節(jié)ECM生物力學特性參與到PF進程，抑制交聯(lián)酶活性可以影響PF的發(fā)展，間接提示ECM生物力學特性的改變在PF進展中起重要作用。

2.1 ECM生物力學特性改變

通過蛋白組學檢測發(fā)現(xiàn)IPF患者各ECM蛋白組分發(fā)生廣泛改變[4]，各種ECM蛋白分子的含量和比例是ECM的硬度的決定因素，ECM的硬度與組織的生物力學特性直接相關(guān)，PF中ECM硬度不斷增加，人肺實質(zhì)正常的硬度為0.44～0.75 kPa，而PF組織的硬度達到了50 kPa[4]。ECM的過度沉積導致ECM的生物力學特性改變。

2.2 ECM生物力學特性改變促進TGF-β的活化

TGF-β是PF發(fā)展中的關(guān)鍵因子，PF中ECM生物力學特性的改變，形成了一個促進TGF-β活化的微環(huán)境。ECM充當了TGF-β儲存器的作用，大量TGF-β以無活性隱性復合前體形式通螯合在ECM之中。整合素αv在TGF-β1的活化過程中起重要作用，其能夠結(jié)合TGF-β1隱性相關(guān)肽(latent-associated peptide，LAP)中精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)序列并通過TGF-β1結(jié)合蛋白鏈接ECM。這種鏈接實現(xiàn)了ECM與TGF-β1隱性復合體之間的力傳導，ECM力學特性的信息能夠通過這種力傳導調(diào)節(jié)TGF-β1的活化[5]。PF中ECM硬度增加使TGF-β隱性復合體發(fā)生機械力依賴性構(gòu)象變化，促使預先存儲在ECM中的隱性復合物前體釋放出活性TGF-β[6]。而應用整合素αvβ1抑制劑可以阻斷ECM生物力學信息的傳遞從而減弱博萊霉素誘導的PF[7]。因此，ECM的生物力學特性改變可以通過力傳導來促進TGF-β的活化而在PF發(fā)展中扮演重要作用，而破壞這種力傳導是潛在的治療靶點。

2.3 交聯(lián)酶調(diào)節(jié)ECM的生物力學特性

PF病理過程中膠原蛋白可以通過交聯(lián)各ECM蛋白并指導ECM內(nèi)的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，同樣影響ECM的生物力學特性使其硬度和穩(wěn)定性增強。在這種膠原交聯(lián)結(jié)構(gòu)內(nèi)，ECM分子對蛋白水解酶抵抗能力增強，并加強了細胞與基質(zhì)之間的相互作用。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidases，LOX)和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase，TG)是ECM中主要兩個調(diào)節(jié)膠原交聯(lián)的酶，血清賴氨酰氧化酶樣蛋白2(serum lysyl oxidase-like，sLOXL2)主要由FB合成和分泌。IPF患者sLOXL2明顯升高，且其升高水平與疾病進展的風險相關(guān)[8]。鼠模型中應用抗LOXL2單克隆抗體可以抑制并逆轉(zhuǎn)博萊霉素誘導的PF，但最新的臨床實驗中LOXL2人源化單克隆抗體并未得到滿意療效[9]，故LOXL2在PF中的作用還需更深的研究。Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG2)通過在谷氨酰胺和賴氨酸側(cè)鏈之間形成異構(gòu)肽來促進ECM蛋白之間的交聯(lián)，從而影響ECM的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。TG2抑制劑的應用及TG2敲除小鼠都表現(xiàn)出明顯的抗纖維化反應[10]。這些研究表明交聯(lián)酶在PF發(fā)展中的重要作用并間接說明了ECM的生物力學特性改變對纖維化進程的影響，而交聯(lián)酶可以作為肺纖維化治療的潛在靶點。

3 ECM的纖維化改變影響ECM的來源

PF中ECM的生物特性的改變同樣可以影響ECM的3個來源，使纖維化的ECM不再需要進一步的原始促發(fā)因素而能夠獨立推動PF的發(fā)生發(fā)展。

3.1 FB的分化

IPF患者肺組織ECM內(nèi)FB具有獨特的增殖和分泌特性。FB向MF分化的特征之一就是α-SMA基因表達的增加，在IPF患者肺組織的ECM上培養(yǎng)正常肺組織來源的FB可以使其α-SMA的表達增加[4]，提示纖維化的ECM能夠誘導FB的分化。肺ECM纖維化改變與FB的活化之間似乎形成一個正反饋回路，而miR- 29下調(diào)在這一過程中起關(guān)鍵作用[11]。一些ECM蛋白可能參與到促FB分化機制。纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是ECM的重要組分，其能結(jié)合其他ECM蛋白協(xié)助形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。FN的mRNA選擇性剪接區(qū)域(extra domain A，EDA)發(fā)生保留性剪接而產(chǎn)生EDA片段陽性的FN亞單位(EDA+-FN)。PF的ECM內(nèi)含有高水平的EDA+-FN，其能夠通過整合素α4β1介導FB的活化[12]，F(xiàn)B活化后繼而上調(diào)FN的表達和分泌，并更快的募集FN形成纖維狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進而加速ECM的重塑，這是MF在PF組織內(nèi)產(chǎn)生并持續(xù)存在的可能原因。但在肝纖維化的研究中FN卻能夠減少LOX的釋放而降低TGF-β的生物效能最終起到抗纖維化的作用[13]，因此FN在纖維化中的具體作用機制還有待進一步明確。此外，腓骨蛋白(fibulin)可以增加FB線粒體的活動并促進其增殖、黏附和分化[14],而骨膜蛋白同樣有促FB分化作用[15]。這些ECM蛋白在PF進程中對于FB活化可能起重要作用。

3.2 EMT

ECM改變同樣可以影響EMT。特定的ECM成分構(gòu)成培養(yǎng)肺泡上皮細胞可以觀察到EMT，PF的ECM成分構(gòu)成改變且硬度增加，而硬度不同的培養(yǎng)基上TGF-β所表現(xiàn)的功能反應不同，低硬度的基質(zhì)能增強TGF-β所介導的細胞凋亡，而高硬度的基質(zhì)上的TGF-β則誘導EMT反應，而這是通過介導磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路通路實現(xiàn)的[16]。應用FN內(nèi)潛在TGF-β復合體結(jié)合域的單克隆抗體或缺乏該結(jié)合域的FN突變體來阻斷ECM與潛在TGF-β的力傳導能夠抑制局部TGF-β驅(qū)動的EMT[17]，間接提示ECM力學特性改變對于EMT的影響。此外，ECM的拓撲結(jié)構(gòu)限制同樣可以通過增加細胞支架的極性而獨立誘導EMT[18]。而作為纖維化發(fā)展中調(diào)節(jié)ECM內(nèi)部結(jié)構(gòu)構(gòu)成的交聯(lián)酶，LOX和TG對EMT同樣具有促進作用，阻斷LOX甚至會出現(xiàn)與EMT完全相反的間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)換(mesenchymal-to-epithelial transition，MET)[19]，間接提示肺ECM生物學特性對于EMT的影響。

3.3 Fibrocytes的趨集分化

在PF等慢性炎性反應疾病中，ECM的改變可以通過免疫調(diào)節(jié)來誘導循環(huán)內(nèi)fibrocytes的趨化遷移，肺纖維化的ECM通過netrin-1介導fibrocytes的趨化聚集，而敲除netrin- 1能夠減弱博來霉素的促纖維化作用[14]，這是肺纖維化的可能治療靶點。Fibrocytes來源于單核細胞譜，體外實驗中單核細胞可以自主分化為fibrocytes，而正常肺組織內(nèi)僅能檢測到單核巨噬細胞，fibrocytes卻幾乎檢測不到。這是因為正常組織中FB通過分泌 slit2來抑制單核細胞向fibrocytes的分化從而抑制纖維化[20]。而PF纖維灶中的slit2水平明顯降低，纖維化ECM微環(huán)境中FB不再分泌slit2，轉(zhuǎn)而分泌骨膜蛋白并介導整合素β1來誘導fibrocytes向MF的分化[15]。這些研究表明PF的ECM微環(huán)境改變能夠影響fibrocytes的遷移、分化并參與PF發(fā)展。

4 ECM相關(guān)蛋白在PF發(fā)展中的作用

近來發(fā)現(xiàn)了幾種基質(zhì)相關(guān)的蛋白在PF發(fā)展中起重要作用，包括前述的骨膜蛋白和纖連蛋白。而腓骨蛋白- 1(fibulin- 1)，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)也進一步闡明了ECM促纖維化的可能機制。

4.1 Fibulin- 1

Fibulin- 1是FB分泌的一種ECM蛋白，其可以協(xié)同其他ECM蛋白促進ECM功能[4]。IPF患者來源的FB相對于正常來源的FB能夠分泌更多的fibulin- 1，而IPF患者肺組織內(nèi)的fibulin- 1水平顯著增高且與肺功能呈負相關(guān)[21]，提示fibulin- 1是PF病程進展的可能生物指標，且可能成為PF治療新靶點。Fibulin- 1C(Fbln1c)是fibulin- 1四個亞型之一。Fbln1c基因敲除小鼠在PF模型中氣道重塑反應減弱，這是因為Fbln1c基因敲除后膠原的交聯(lián)障礙并阻斷了各種ECM蛋白之間的相互作用[22]。Fibulin- 1C的7個片段序列中，F(xiàn)BLN1C1片段能夠使FB細胞的黏附增加，增強FB內(nèi)的線粒體活動并促進FB的增殖，使ECM蛋白的沉積增加[14]，進一步闡明了fibulin- 1在促PF發(fā)展的可能作用機制并提供了新的可能治療靶點。

4.2 OPN

肺內(nèi)OPN是一種主要由肺泡巨噬細胞分泌的ECM蛋白，但在PF中細胞應激可以通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路來誘導肺泡II型上皮細胞OPN分泌的增加。OPN與多種器官的炎性反應和纖維化作用相關(guān)，其能夠影響細胞與ECM之間相互作用，并調(diào)節(jié)TGF-β1和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達[23]。IPF患者和PF模型肺內(nèi)OPN水平都顯著增加，其通過調(diào)節(jié)能夠分泌白介素- 17/干擾素-γ的T細胞比率在PF中起重要作用[24]。二氧化硅誘導的PF敏感性存在的性別差異并且這種差異與OPN水平相關(guān)[25]，由此可能解釋PF患病率和生存率的性別差異問題。

5 問題與展望

綜上所述，PF病理性ECM微環(huán)境改變能夠驅(qū)動異常細胞行為，例如細胞增殖、遷移、分化、EMT以及各種分泌型介質(zhì)的產(chǎn)生和激活從而而在PF的發(fā)展中起重要推動作用。ECM在PF中的促纖維化作用研究取得了一定進展，但其作用機制還需進一步明確。迄今少有治療是針對纖維化ECM的，雖然我們了解各種細胞通過改變ECM蛋白成分結(jié)構(gòu)影響其生物學特性，但具體的信號通路尚不明確，并且各種ECM蛋白在特定生物學特性所起的作用還有待進一步區(qū)分。而正常的ECM調(diào)節(jié)機制又是如何在纖維重塑中失衡還有待深入，這些對于調(diào)控ECM微環(huán)境以期作為PF的治療靶點至關(guān)重要，也是今后研究的重要方向。

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