張金李，馮 翔

(1.河南省開封市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 475000；2.河南省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,鄭州 450018)

近年來，病毒引起的新發(fā)傳染病逐漸增多，對人類影響也越來越大，迅速準(zhǔn)確的病原體診斷是治療和防止暴發(fā)流行的最重要的步驟之一[1]。目前，病原體的診斷所用到的技術(shù)越來越多，基于不依賴序列擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合宏基因組的方法已成功用于檢測和發(fā)現(xiàn)新病毒，即使在病毒數(shù)量很低的情況下，融合以上技術(shù)優(yōu)勢的高通量測序技術(shù)具備檢測所有病毒的能力[2-3]。本文應(yīng)用Ion torrent高通量測序平臺對兒科1例重癥肺炎患者進(jìn)行病毒宏基因組分析，初步探討其在臨床病原體診斷中的應(yīng)用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 肺泡灌洗夜標(biāo)本(BALF)來源于開封市中心醫(yī)院兒科1例重癥肺炎患兒，臨床診斷為右肺肺炎，實(shí)驗(yàn)室診斷為肺炎支原體感染。給予紅霉素、哌拉西林鈉他唑巴坦、阿奇霉素抗感染治療，效果不明顯，臨床醫(yī)生懷疑其合并病毒感染。

1.2儀器與試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒購自MN公司；Ion torrent測序配套試劑購自Themo熱科學(xué)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根公司；長鏈高保真PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase及Ex Taq PCR試劑購自于寶生物工程有限公司；腺病毒熒光定量試劑盒購自達(dá)安基因公司；所用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海英濰捷基公司合成；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1肺泡灌洗夜標(biāo)本病毒DNA/RNA提取 肺泡灌洗液標(biāo)本處理：8 000 r/min，離心15 min，上清用于病毒基因組提取，DNA/RNA提?。喝∩锨?50 μL，試劑購于MN公司(NucleoSpin?RNA Virus 740956.10)，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。為了同時提取DNA病毒核酸，70 ℃水浴之前加入20 mg/mL蛋白酶K溶液20 μL。

1.3.2病毒DNA/RNA的隨機(jī)引物擴(kuò)增 取2 μL核酸，加入1 μL 100 pmol/μL接頭引物FR26RV-N(5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TCN NNN NN-3′)，75 ℃作用5 min后置冰浴2 min。按比例加入FastQuant RT試劑，42 ℃反應(yīng)50 min，95 ℃ 反應(yīng)2 min合成cDNA；加1 μL(2.5 U)DNA聚合酶Klenow片段，2 μL FR26RV-N(10 pmol)，2.5 μL 10×buffer，37 ℃反應(yīng)60 min合成dsDNA，75 ℃滅活10 min。取上述反應(yīng)液模板5 μL，加2 μL PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，10 μL 5×PrimeSTAR?GXL緩沖液，4 μL dNTP混合物，4 μL 10 pmol/μL的擴(kuò)增引物FR20RV(5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TC-3′)，雙蒸水補(bǔ)充至50 μL，經(jīng)不依賴序列的單引物擴(kuò)增：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后采用Qubit2.0進(jìn)行產(chǎn)物定量。

1.3.3高通量測序 文庫構(gòu)建、文庫擴(kuò)增以及測序按照試劑盒和儀器說明書進(jìn)行。取100 ng純化之后的產(chǎn)物，BioRuptor超聲系統(tǒng)隨機(jī)打斷至200 bp，采用Ion XpressTMPlus DNA Fragment Library kit試劑盒連接接頭；采用2% E-gel選擇回收大小在330 bp的條帶并采用Qubit2.0進(jìn)行文庫定量。油包水聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和磁珠顆粒(ISPS)富集采用Ion OneTouchTM200 Template Kit v2和Ion OneTouchTM進(jìn)行油包水PCR；采用Ion Xpess template kit，MyOne streptavidin C1 beads和Ion OneTouchTMES進(jìn)行模板富集。采用Ion PGMTMSequencing 200 kit及Ion 314TMChip進(jìn)行測序，260個測序循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)壓縮氬氣進(jìn)行驅(qū)動。

1.3.4腺病毒熒光定量PCR驗(yàn)證 使用達(dá)安腺病毒熒光定量檢測試劑盒，進(jìn)行腺病毒驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1高通量測序初步結(jié)果 芯片有效區(qū)域達(dá)到82%，其中連接有文庫的有99%，除去36%多克隆、4%低質(zhì)量和1%測試片段，最終有效的文庫占59%，共591 593個讀取片段，測序平均讀長為159 bp，最長讀長為333 bp，產(chǎn)生的測序原始數(shù)據(jù)總量為93.6 Mb，Q20為73.46 Mb。

2.2本地Blast及相關(guān)病毒分析結(jié)果 Fastq格式數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為fasta格式，選擇一致性大于70%，E-value<10-5的序列作為有意義的序列，經(jīng)本地Blast進(jìn)行序列分類，一共獲得591 593條讀長，其中人類序列206 469條，占41%；細(xì)菌序列76 794條(15.0%)；真菌序列1 415條(0.3%)，其中病毒序列3 545條，占(0.6%)；病毒病原體主要有腺病毒序列1 760條(49.6%)，淋巴囊腫疾病病毒序列1 422條(40.1%)；Taterapox病毒65條(1.8%)，智利巨型病毒37條(1.0%)，云杉卷蛾雕背姬蜂病毒33條(0.9%)，貓白血病病毒32條(0.9%)，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生證病毒30條(0.8%)，RD-114逆轉(zhuǎn)錄病毒18條(0.5%)，其他病毒共148條(4.2%)。

2.3腺病毒熒光定量PCR結(jié)果 呼吸道病原體熒光定量PCR結(jié)果為腺病毒7型，CT值為27.04。提示患者腺病毒7型感染。

3 討 論

本研究通過采用不依賴序列的單引物擴(kuò)增技術(shù)的病毒宏基因組方法結(jié)合Ion Torrent高通量測序平臺對兒科重癥肺炎患兒呼吸道肺泡灌洗液進(jìn)行病毒病原體宏基因組分析，快速篩選出了標(biāo)本中含有的腺病毒及其他病毒基因序列，整個試驗(yàn)只需2～3 d就能完成，測序成本也低至幾千元，提示這種不依賴序列的病原體鑒定技術(shù)由于不需要預(yù)先知道病原體基因組信息，也不用專門針對病原體設(shè)計(jì)多對引物，特別適合于醫(yī)院、疾病預(yù)防控制中心等機(jī)構(gòu)在某種突發(fā)傳染病的早期采用這種技術(shù)手段進(jìn)行病毒性病原體鑒定，這種技術(shù)已成功用于病毒的鑒定、病毒基因組測序、輸血制品病原體的篩選等[4]。

腺病毒7型是臨床常見的病原體類型，主要引起上呼吸道急性感染，是社區(qū)獲得性肺炎及重癥肺炎的重要病原體[5]，患者肺泡灌洗液標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)其他病毒種類序列的存在，淋巴囊腫病毒-中國株是引起上百種淡、海水魚產(chǎn)生囊腫的主要病原體，暫無人感染病例的報(bào)道，其他如Taterapox病毒、智利巨型病毒、云杉卷蛾雕背姬蜂病毒等也暫時無人感染病例[6]。

本次測序數(shù)據(jù)中人類基因組序列所占比例較大，病毒序列只占很少一部分，與國內(nèi)研究相似[7]，分析原因可能因?yàn)榉闻莨嘞匆褐泻写罅康乃拗骷?xì)胞，標(biāo)本提取前未經(jīng)使用過濾系統(tǒng)去除宿主細(xì)胞等體積較大的物質(zhì)，也未加入DNA酶和RNA酶去除標(biāo)本提取前存在的裸DNA和RNA有關(guān)。另外也可能與標(biāo)本中腺病毒濃度有關(guān)，標(biāo)本熒光定量PCR結(jié)果顯示腺病毒CT值為27.04,腺病毒序列拼接基因組覆蓋度79%，測序品均深度8×。有研究者發(fā)現(xiàn)，如果標(biāo)本中病毒粒子的濃度大于107個/μL，則較容易獲得相關(guān)病毒的全基因組序列及較高的測序深度[8-9]。相對于DNA病毒，高通量技術(shù)檢測RNA病毒相對容易[10]。有試驗(yàn)證明，標(biāo)本提取核酸之前依次進(jìn)行高速離心、過濾和酶處理3步法處理能夠富集病毒粒子，提高測序數(shù)據(jù)中病毒序列所占的比例[11]。

測序過程一個重要的挑戰(zhàn)是數(shù)據(jù)分析，雖然有一些開放平臺給研究者使用，如MetaVir和Vipie可免費(fèi)使用，但是分析過程及等待時間均較長。因此，各個實(shí)驗(yàn)室及科研平臺應(yīng)該建立適合自己的平臺，提高病原體檢測速度。