曲瑞紅， 劉鳳娟， 畢春曉， 宋瑤瑤， 胡 鑫， 徐全樂

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 楊凌712100)

山黧豆(Lathyrussativus)，又叫家山黧豆，是山黧豆屬187種作物中的唯一栽培品種[1-2]。因?yàn)槠淞己玫墓痰芰?、較高的蛋白含量、廣譜的抗逆性等優(yōu)良生物學(xué)特征而成為干旱、半干旱地區(qū)重要的食用和飼用作物[3-5]。然而，內(nèi)源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)的存在極大的限制了其推廣應(yīng)用價(jià)值[6-7]。在山黧豆發(fā)育過程中，β-ODAP的合成與積累有兩個(gè)明顯的高峰：一個(gè)在種子萌發(fā)期，一個(gè)在種子成熟期[8]。代謝組學(xué)的研究表明，β-ODAP的積累與氮代謝、硫代謝、嘌呤代謝和嘧啶代謝等基礎(chǔ)代謝途徑密切相關(guān)[9]。尤其是尿嘧啶降解產(chǎn)生的β-丙氨酸可能是β-ODAP含量的調(diào)控信號(hào)[9]。

在種子萌發(fā)過程中，蛋白酶參與了儲(chǔ)藏蛋白水解等多種生理過程，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供氮源并在種子萌發(fā)的生化機(jī)制中扮演重要作用[10-12]。目前，許多重要的蛋白酶類已經(jīng)得到了純化和鑒定[13-15]。例如，Jamir和Seshagirirao[16]從卡薩蒙納姜塊根中分離了一種半胱氨酸蛋白酶并對(duì)其生化性質(zhì)和抗氧化特征進(jìn)行了研究；Asano等[13]從大豆子葉分離了兩個(gè)半胱氨酸蛋白酶D3-α和β。在山黧豆中，Rajyalakshmi[17]發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶在干種子中活性較高，但在萌發(fā)種子中活性較低。Ramakrishna等[15]從山黧豆干種子中純化和鑒定了Zn2+依賴型的金屬蛋白酶。由于種子萌發(fā)過程中β-ODAP的大量積累與氮源密切相關(guān)，而蛋白酶類在儲(chǔ)藏蛋白的水解及氮源的提供中扮演重要作用，因而山黧豆種子萌發(fā)特異性蛋白酶的分離純化及性質(zhì)研究對(duì)于加深β-ODAP積累的理解就顯得極其重要。

本研究擬檢測(cè)山黧豆種子萌發(fā)過程中的蛋白酶活性變化，并采用鹽析和離子交換層析等方法對(duì)蛋白酶進(jìn)行分離純化。在此基礎(chǔ)上，分析不同金屬離子、pH、溫度及底物對(duì)蛋白酶活性的影響，為進(jìn)一步研究蛋白酶活性與β-ODAP積累的關(guān)系奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 不同萌發(fā)時(shí)間山黧豆種子蛋白酶提取及明膠酶譜法檢測(cè)

取山黧豆(Lathyrussativus)干種子50粒，室溫浸泡2 h后于30℃，黑暗條件下萌發(fā)。分別取干種子及2，4，6，8，10 DAS(days after sowing)萌發(fā)種子200 mg于1 mL Tris-HCl(50 mM，pH7.0，含100 mM NaCl，1 mM EDTA)緩沖液中研成勻漿(冰浴)。室溫浸提20 min后，4 000 rpm×5 min取上清，利用考馬斯亮藍(lán)G250法檢測(cè)蛋白含量。

采用明膠酶譜法檢測(cè)上述提取蛋白酶活性[18]。向等蛋白量上述各樣品中加入2×SDS上樣緩沖液，并配置含0.04%明膠(Bio-Rad，USA)的10%聚丙烯酰胺凝膠，于4℃進(jìn)行SDS-PAGE電泳(含β-巰基乙醇，上樣前無(wú)熱變性)。用蒸餾水洗滌凝膠2次以除去SDS，每次5 min；再將其置于pH5.5的檸檬酸磷酸緩沖液(含180 mM NaCl，2 mM DTT)中，30℃溫育過夜。凝膠經(jīng)進(jìn)一步考染、脫色后，用凝膠成像系統(tǒng)(Omega Lum G，Aplegen)觀察、記錄，并使用Quantity one 4.52對(duì)蛋白酶相對(duì)活性進(jìn)行定量分析。

1.2 Ks分段鹽析

取山黧豆萌發(fā)6 d種子35 g，加50 mM Tris-HCl(pH7.0，含100 mM NaCl)100 mL研磨成勻漿。4℃，10 000 g×20 min后取上清測(cè)量體積并用紗布過濾，采用0～40%飽和度的NH4SO4(27.12 g)進(jìn)行鹽析。15 min后，4℃，10 000 g×20 min，得沉淀1。上清測(cè)量體積后采用40～80%飽和度的NH4SO4(25.8 g)進(jìn)行分段鹽析，操作同上述。4℃，10 000 g×20 min得沉淀2。沉淀1和2分別用10 mL 1×透析緩沖液(pH 7.0，40 mM磷酸鈉緩沖液，2 mM EDTA)溶解并注射到透析盒(Slide-A-Lyzer 3.5K，Thermo Scientific)。透析盒經(jīng)薄膜封口，置于透析緩沖液中攪拌過夜。所有操作均在冰浴上進(jìn)行。

從透析盒分別抽取上述溶液，置于15 mL離心管中，4℃，8 000 g×15 min。取上清經(jīng)12%SDS-PAGE和明膠酶譜法檢測(cè)，其余備用。

1.3 離子交換層析

采用二乙氨基乙基纖維素(Diethylaminoethyl Cellulose)DE52(Whatman)裝柱，用60 mL透析緩沖液洗柱，平衡。上樣后用500 mM NaCl梯度洗脫并收集組分。各組分用明膠酶譜法(不含β-巰基乙醇，上樣前無(wú)熱變性)檢測(cè)蛋白酶純化情況。

1.4 Proteinase酶活的影響因素測(cè)定

用0～100 mg·L-1酪氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考Kembhavi等[19]方法檢測(cè)山黧豆蛋白酶活性，略有修改。將50 μL酶液添加到950 μL Tris-HCl(pH8.0，含2 mM CaCl2和0.5% 干酪素)，37℃溫育1 h后用0.5 mL TCA(20%)終止反應(yīng)。室溫放置15 min后，13 000 g離心15 min，取上清在波長(zhǎng)280 nm下測(cè)吸光度值。以水代替酶液設(shè)置對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)三個(gè)重復(fù)。以每分鐘釋放1 mM Tyr為一個(gè)酶活單位(U)。

用1 mM EDTA，EGTA，尿素(Urea)及不同金屬離子CaCl2，CoCl2，F(xiàn)eCl3，MgCl2，MnCl2，ZnCl2等處理酶液，或利用不同pH(4～11)，不同溫度(30，40，50，60，70℃)，不同底物種類(牛血清白蛋白、干酪素、明膠、血紅蛋白、奶粉)等檢測(cè)山黧豆蛋白酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 山黧豆種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)降解與蛋白酶活性檢測(cè)

利用10% SDS-PAGE分析山黧豆萌發(fā)不同時(shí)期的種子可溶性蛋白特征顯示：隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，山黧豆高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(>31 KD)含量顯著降低，而較低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(≤31 KD)含量顯著增加(圖1A)。這說明在山黧豆種子萌發(fā)的過程中伴隨著高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的逐步水解。但是在萌發(fā)過程中可溶性蛋白含量變化不大。

進(jìn)一步利用明膠酶譜法檢測(cè)山黧豆不同萌發(fā)時(shí)期種子蛋白酶活性顯示：除干種子外，不同萌發(fā)時(shí)期的山黧豆種子蛋白在聚丙烯酰胺凝膠藍(lán)色背景上均呈現(xiàn)透亮條帶，位于97 KD處(圖1B)。條帶亮度觀察及Quantity one定量分析表明，山黧豆種子在不同萌發(fā)時(shí)期(2～10天)的蛋白酶活性基本一致。這說明在山黧豆種子的萌發(fā)過程中伴隨著蛋白酶的激活，并造成了高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的逐步水解和低分子質(zhì)量蛋白的積累。

圖1 不同萌發(fā)時(shí)期山黧豆種子可溶性蛋白(A)及蛋白酶活性(B)的電泳分析Fig.1 Soluble protein (A) and protease activity (B) analysis of Lathyrus sativus seeds with different days after sowing注：M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1：干種子，2：2 DAS，3：4 DAS，4：6 DAS，5：8 DAS，6：10 DASNote:M:protein molecular weight markers,1:dry seed,2:2 DAS,3:4 DAS,5:8 DAS,6:10 DAS

2.2 山黧豆種子蛋白酶的純化

取萌發(fā)6 d的山黧豆種子提取可溶性蛋白，采用0～40%和40～80%飽和度的NH4SO4進(jìn)行分段鹽析。SDS-PAGE結(jié)果表明，大于31 KD的較高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)在0～40%飽和度條件下析出較多，而小于31 KD的較低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)在40～80%飽和度條件下析出較多(圖2A)。這說明對(duì)Ks鹽析法而言，相對(duì)分子質(zhì)量越大的蛋白質(zhì)越容易沉淀。因而，山黧豆蛋白酶在0～40%飽和度條件下更有可能析出；進(jìn)一步明膠酶譜檢測(cè)也表明0～40%飽和度條件下析出的蛋白酶活性更高，大約占蛋白酶總活性的65%(圖2B)。

圖2 分段鹽析的SDS-PAGE(A)和明膠酶譜法(B)檢測(cè)Fig.2 Analysis of the products after fractional salting out with SDS-PAGE (A) and SDS-gelatin-PAGE (B)注：A：15% SDS-PAGE，B：12%SDS-PAGE。M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，3，5：0～40%飽和度，2，4，6：40～80%飽和度；1～2：5 μL，3～4：10 μL，5-6：15 μLNote:A:15% SDS-PAGE,B:12% SDS-PAGE. M:protein molecular weight markers,1,3,5:0～40% NH4SO4 saturation,2,4,6:40～80% NH4SO4 saturation;1～2:5 μL，3～4:10 μL，5～6:15 μL

取上述0～40% NH4SO4飽和度鹽析蛋白，通過DE52陰離子交換柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。明膠酶譜分析顯示，在聚丙烯酰胺凝膠不含β-巰基乙醇時(shí)，蛋白酶條帶遷移率明顯變大(圖3)。說明山黧豆蛋白酶可能含有二硫鍵，在β-巰基乙醇存在時(shí)，二硫鍵被破壞，蛋白酶形狀可能呈現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài)，電泳遷移率較小(圖1B，圖2B)；在無(wú)β-巰基乙醇時(shí)，蛋白酶結(jié)構(gòu)更為緊密，泳動(dòng)速度加快(圖3)。此外，在未結(jié)合蛋白中可見少量蛋白酶條帶；但在NaCl梯度洗脫時(shí)，蛋白酶條帶數(shù)目增多且清晰(圖3，14～17泳道)。收集上述蛋白酶液，用于進(jìn)一步檢測(cè)蛋白酶活性的影響因素。

對(duì)于上述純化蛋白進(jìn)行總蛋白含量、酶活力、酶比活力等檢測(cè)表明，經(jīng)鹽析和離子交換兩步純化，山黧豆蛋白酶的純化倍數(shù)為6.58，蛋白得率為7.97%(表1)。略低于山黧豆金屬蛋白酶及其他物種半胱氨酸蛋白酶等的純化效率[15-16]。因而，本研究所獲山黧豆種子萌發(fā)特異性蛋白酶的分離純化條件還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 經(jīng)DE52陰離子交換柱層析純化蛋白酶的明膠酶譜檢測(cè)Fig.3 Analysis of the products after ion exchange chromatography of DE52 with SDS-gelatin-PAGE注：M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1～10：未結(jié)合蛋白，11～22：洗脫蛋白Note:M:protein molecular weight markers,1～10:unbound proteins, 11～22:bound fractions

2.3 山黧豆種子蛋白酶活的影響因素

分別向酶反應(yīng)液中添加1mM的Ca2+，Co2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+等不同金屬離子及蛋白酶抑制劑EDTA，EGTA和尿素等，檢測(cè)其對(duì)山黧豆蛋白酶活力的影響。結(jié)果表明，大部分金屬離子對(duì)酶活力的影響不大，說明山黧豆蛋白酶對(duì)金屬離子的耐受性較高。值得注意的是，添加Fe3+導(dǎo)致蛋白酶活性的顯著增加(圖4A)。此外，尿素和EDTA對(duì)蛋白酶活性有一定的抑制作用，EGTA則作用不大。

以牛血清白蛋白、干酪素、明膠、血紅蛋白和奶粉等為不同底物，檢測(cè)山黧豆蛋白酶活性變化。結(jié)果表明山黧豆蛋白酶對(duì)上述底物均表現(xiàn)出較高活性，其中血紅蛋白和明膠的活性最高，可能是最適反應(yīng)底物(圖4B)。

取等體積酶液在不同pH條件下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖4C所示。山黧豆蛋白酶在pH7時(shí)活性最大，但在其他pH條件下也能保持70%以上相對(duì)活性，表現(xiàn)出較好的酸堿耐受性。而且蛋白酶活性變化沒有表現(xiàn)為平滑曲線，略有起伏，可能是由于所純化樣品由多個(gè)蛋白酶混合造成的。

表1 山黧豆蛋白酶的分離純化Table 1 Purification of proteases from Lathyrus sativus

在不同反應(yīng)溫度下，檢測(cè)山黧豆蛋白酶活力變化。由圖4D可知，蛋白酶在30～70℃范圍內(nèi)活性較高，均能保持90%以上相對(duì)活性，其最適反應(yīng)溫度為60℃(圖4D)。

3 討論

目前，僅在野豌豆、蕎麥等少數(shù)物種的干種子中發(fā)現(xiàn)了蛋白酶，但其生理功能尚不明確[10,20]。在種子萌發(fā)過程中，蛋白酶則廣泛存在，其主要類型是半胱氨酸蛋白酶，在儲(chǔ)藏蛋白的水解和轉(zhuǎn)運(yùn)過程扮演重要作用[10]。大多數(shù)植物半胱氨酸蛋白酶都屬于papain(木瓜蛋白酶)家族和legumain(豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶)家族[21]。Fischer等[22]在野豌豆中分析了papain家族和legumain家族的表達(dá)模式，在種子萌發(fā)早期檢測(cè)到了半胱氨酸蛋白酶的特異表達(dá)并參與了球蛋白的降解。本研究利用明膠酶譜法檢測(cè)了山黧豆種子萌發(fā)過程中蛋白酶的特異表達(dá)，并通過SDS-PAGE觀察和分析了種子萌發(fā)過程中高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的逐步水解和轉(zhuǎn)運(yùn)。由山黧豆的缺素培養(yǎng)[8]及代謝組學(xué)[9]研究可知，氮/氮代謝是β-ODAP含量的關(guān)鍵影響因素。因而，山黧豆種子萌發(fā)特異性蛋白酶作用下的蛋白水解及轉(zhuǎn)運(yùn)可能與β-ODAP在此過程中的大量積累關(guān)聯(lián)。

圖4 不同化合物(A)、反應(yīng)底物(B)、pH(C)、溫度(D)對(duì)山黧豆蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of different factors of chemicals (A),substrates (B),pH (C) and temperature (D) on activities of proteases in Lathyrus sativus

4 結(jié)論

本研究檢測(cè)了山黧豆蛋白酶在種子萌發(fā)期的特異表達(dá)和在該時(shí)期種子高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)水解中的作用，繼而從萌發(fā)6 d的種子中純化了該蛋白酶并對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。所獲山黧豆蛋白酶的純化倍數(shù)為6.58，得率為7.97%；該蛋白酶對(duì)金屬離子的耐受性較高，但受Fe3+影響較為顯著；此外，山黧豆蛋白酶對(duì)血紅蛋白和明膠的反應(yīng)活性最高，其最適反應(yīng)pH和溫度分別為pH7和60℃。本研究為進(jìn)一步研究山黧豆種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)水解對(duì)其內(nèi)源毒素β-ODAP積累的影響奠定了一定的基礎(chǔ)。