李夢(mèng)琦， 何興東*， 楊祥祥， 丁新峰， 趙月丹， 高玉葆，尤萬(wàn)學(xué)， 余 殿， 蔡 莉

(1. 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300071； 2. 寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局， 寧夏 751501)

草酸鈣是植物體內(nèi)鈣的一種生物礦化形式[1-2]，廣泛分布于植物不同組織及器官中[2-3]。在藻類、低等維管植物、裸子植物和被子植物中，均發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體的沉積，其中以高等植物體內(nèi)含量最為豐富[4-6]。草酸鈣在植物中主要是以一水草酸鈣(CaC2O4·H2O，COM，單斜晶系)的形式存在，以二水草酸鈣(CaC2O4·2H2O，COD，四方晶系)形式存在的數(shù)量極少且不穩(wěn)定[4,7]。草酸鈣晶體的形態(tài)和大小各異，常見(jiàn)的晶體形態(tài)包括針晶體、柱狀晶、多種形狀的棱柱晶、晶體砂和晶簇5類[6-8]。草酸鈣晶體通常在植物組織里一種特化細(xì)胞的液泡中聚積，這種細(xì)胞被稱為含晶異細(xì)胞(crystal idioblast)[7-9]，可簡(jiǎn)稱含晶細(xì)胞或者晶異細(xì)胞。

植物體內(nèi)草酸鈣晶體是由內(nèi)源合成的草酸和外源吸收的鈣離子(Ca2+)共同反應(yīng)形成的產(chǎn)物，這一過(guò)程并不是簡(jiǎn)單的化學(xué)沉淀，而是由嚴(yán)格的遺傳調(diào)控的[10]。草酸鈣晶體具有一定的形態(tài)特征，可能與植物的防御、保護(hù)有關(guān)[5]。晶體的形成能夠抵御昆蟲、牲畜等的取食[9-12]。此外，草酸鈣晶體的形成也是一種鈣調(diào)節(jié)機(jī)制[13]。草酸鈣是提供細(xì)胞Ca2+的臨時(shí)“鈣庫(kù)”，在維持胞內(nèi)外Ca2+平衡、提高植物抗逆性及維持細(xì)胞在逆境條件下的正常生長(zhǎng)發(fā)育等方面擔(dān)負(fù)著重要作用[14]。盡管鈣離子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，但是高濃度的游離鈣離子對(duì)細(xì)胞是有毒害的，草酸鈣的沉淀可以消除過(guò)量的游離鈣離子，并且將鈣貯藏，以備不時(shí)之需[15]。針晶體的形成既和Ca2+調(diào)節(jié)有關(guān)，又與植物防御有關(guān)，而晶簇(球形)的形成只和Ca2+調(diào)節(jié)有關(guān)，且晶簇的形成隨Ca2+水平波動(dòng)[10]。含晶細(xì)胞有較高的滲透勢(shì)，在外界環(huán)境水分狀況較好和導(dǎo)管中水分輸導(dǎo)良好時(shí)，它們吸收并貯存水分；當(dāng)外界環(huán)境干旱缺水時(shí)，導(dǎo)管中水分輸導(dǎo)受阻，不能正常供給植物體內(nèi)各部分對(duì)水分的需求時(shí)，它們可為周邊細(xì)胞提供一個(gè)較為濕潤(rùn)的小環(huán)境，從而提高植物的抗旱性[10]。草酸鈣還參與重金屬脫毒的過(guò)程[5,16]。微量的鋁就能抑制根的生長(zhǎng)，影響植物獲得水分和養(yǎng)料，而植物體內(nèi)草酸鈣晶體可以和鋁結(jié)合，草酸也可以和鋁螯合形成無(wú)毒的草酸鋁[5]，從而減輕毒害。草酸鈣其他功能還有光的聚集反射和組織支持等[4,10,17-18]。綜上所述，植物草酸鈣具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

以往植物體內(nèi)草酸鈣的測(cè)定都是采用顯微技術(shù)觀察晶體[2,8,13]，很少用化學(xué)方法測(cè)定不同植物體內(nèi)草酸鈣的含量，相對(duì)而言，用化學(xué)方法測(cè)定更簡(jiǎn)便快捷。本研究用鈣測(cè)定的連續(xù)組分法[19-20]測(cè)定了寧夏鹽池北部的寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(植被為荒漠化草原)和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗中北部(植被為典型草原)植物體內(nèi)的草酸鈣，旨在服務(wù)于植物的抗逆生理和受損植被的恢復(fù)研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

實(shí)驗(yàn)植物樣品采自半干旱區(qū)兩個(gè)草原植被帶，即寧夏鹽池縣北部的寧夏哈巴湖國(guó)家自然保護(hù)區(qū)和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗中北部的桑根達(dá)來(lái)東南部。寧夏鹽池縣寧夏哈巴湖國(guó)家自然保護(hù)區(qū)屬荒漠化草原帶，經(jīng)緯度106°53′11″～107°38′10″ E，37°38′36″～38°02′00″ N，海拔1 300～1 622 m，年均氣溫7.7℃，年均降水量296.5 mm，年均蒸發(fā)量2 131.7 mm；土壤屬流動(dòng)風(fēng)沙土、半固定風(fēng)沙土和固定風(fēng)沙土，植物群落主要為生長(zhǎng)在流動(dòng)、半固定和固定沙地的沙柳(Salixpsammophila)群落和油蒿(Artemisiaordosica)群落，主要植物有沙柳、油蒿、蟲實(shí)(Corispermumdeclinatum)、黃蒿(A.scoparia)、阿爾泰狗娃花(Heteropappusaltaicus)、地稍瓜(Cynanchumthesioides)、白草(Pennisetumcentrasiaticum)、長(zhǎng)芒草(Stipabungeana)、賴草(Aneurolepidiumdasystachys)、華灰早熟禾(Poasinoglauca)、糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)、苦豆子(Sophoraalopecuroides)、沙地旋復(fù)花(Inulasalsoloides)、草木樨狀黃芪(Astragalusmelilotoides)、披針葉黃華(Thermopsislanceolata)和楊柴(Hedysarummongolicum)等。內(nèi)蒙古正藍(lán)旗屬典型草原帶，經(jīng)緯度115°00′～116°43′ E，41°56′～43°07′ N，海拔1 300～1 600 m，年均氣溫1.5℃，年均降水量370.7 mm，年均蒸發(fā)量1 931.4 mm。土壤屬栗鈣土、淡栗鈣土和固定風(fēng)沙土，植物群落主要為克氏針茅(Stipakrylovii)群落、羊草(Leymuschinense)群落、榆樹(Ulmuspumila)群落和小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)群落，主要植物有克氏針茅、羊草、榆樹、小葉錦雞兒、狼毒(Stellerachamaejasme)、黃囊苔(Carexkorshinskyi)、糙隱子草、展枝唐松草(Thalictrumsquarrosum)、麻花頭(Serratulachinensis)、地榆(Sanguisorbaofficinalis)、達(dá)烏里龍膽(Gentianadahurica)、星毛委陵菜(Potentillaacaulis)、菊葉委陵菜(Potentillatanacetifolia)、北蕓香(Haplophyllumdauricum)、大花飛燕草(Delphiniumgrandiflorum)和叉分蓼(Polygonumdivaricatum)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集 2016年7月在寧夏鹽池縣境內(nèi)的寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)采集91種植物，2017年7月在內(nèi)蒙古正藍(lán)旗桑根達(dá)來(lái)采集77種植物。每種植物分別選擇3株，每種采集葉3～5 g，裝于紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室，將植物樣陰干，兩個(gè)月后用于草酸鈣含量測(cè)定。

1.2.2草酸鈣含量測(cè)定 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前研究中摸索得出的方法，每種植物樣品稱取2份，每份質(zhì)量在0.01～0.02 g，置于2個(gè)研缽中，分別加入1 mL的1. 05 mol·L-1稀醋酸和1 mL的1 mol·L-1稀鹽酸，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到7 mL的離心管中；再分別加入相應(yīng)溶液4 mL沖洗，轉(zhuǎn)入離心管；7 000 rpm離心15 min，得到的上清液即為提取液。在2個(gè)50 mL的錐形瓶中分別加入0.94 mL和0.91 mL的4 mol·L-1NaOH，再分別加入去離子水1.06 mL和1.09 mL，然后均加入3 mL提取液和3 mL三乙醇胺(1：2水溶液)。在配好的溶液中加入鈣羧酸指示劑0.08 g，用標(biāo)定好的EDTA溶液滴定，當(dāng)溶液的顏色由紫紅色變?yōu)榱了{(lán)色時(shí)停止滴定，記錄滴定液的體積。草酸鈣含量的計(jì)算公式為：草酸鈣含量/mg·g-1=

式中：CEDTA為EDTA溶液的濃度，V"EDTA為鹽酸處理組所用EDTA的體積，m"為鹽酸處理組的樣品質(zhì)量，V＇EDTA為醋酸處理組所用EDTA的體積，m＇為醋酸處理組的樣品質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[21,24]，對(duì)兩地植物所屬光合途徑類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用SPSS 22.0軟件對(duì)兩地禾本科草本和非禾本科草本草酸鈣含量之間的差異以及C3植物和C4植物草酸鈣含量之間的差異進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏哈巴湖自然保護(hù)區(qū)和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗采集植物葉草酸鈣

在寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，草酸鈣含量最高的植物是豬毛菜(Salsolacollina)(105.77 g·kg-1)、沙蓬(Agriophyllumsquarrosum)(94.28 g·kg-1)、尖頭葉藜(Chenopodiumacuminatum)(75.49 g·kg-1)、草原石頭花(Gypsophiladavurica)(73.92 g·kg-1)、蟲實(shí)(Corispermumdeclinatum)(63.28 g·kg-1)，草酸鈣含量最低的植物是沙鞭(Psammochloavillosa)(0.90 g·kg-1)和長(zhǎng)芒草(Stipabungeana)(1.19 g·kg-1)(表1)。

在內(nèi)蒙古正藍(lán)旗桑根達(dá)來(lái)，草酸鈣含量最高的植物是灰綠藜(Chenopodiumglaucum)(84.87 g·kg-1)、豬毛菜(61.10 g·kg-1)、堿地膚(Kochiascopariavar.sieversiana)(50.90 g·kg-1)，草酸鈣含量最低的植物是糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)(0.65 g·kg-1)、阿爾泰狗娃花(Heteropappusaltaicus)(1.23 g·kg-1)、披針葉黃華(Thermopsislanceolata)(1.30 g·kg-1)、苦荬菜(Ixerisdenticulata)(1.48 g·kg-1)(表1)。

2.2 C3植物和C4植物體內(nèi)草酸鈣含量比較

在寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，所采集到的C4植物有豬毛菜、沙蓬、尖頭葉藜、白草(Pennisetumcentrasiaticum)、堿地膚、霧冰藜(Bassiadasyphylla)、中亞濱藜(Atriplexcentralasiatica)、蒺藜(Tribulusterrester)、虎尾草(Chlorisvirgata)和糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)；在內(nèi)蒙古正藍(lán)旗，所采集到的C4植物有灰綠藜、豬毛菜、堿地膚、木地膚(K.prostrata)、白草、狗尾草(Setariaviridis)、大籽蒿(Artemisiasieversiana)、展枝唐松草(Thalictrumsquarrosum)和糙隱子草；除了哈巴湖自然保護(hù)區(qū)的地木耳(Nostoccommune)和發(fā)菜(N.communevar.flagelliforme)，兩地其他植物均為C3植物。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，兩地C4植物的草酸鈣含量均顯著高于C3植物的草酸鈣含量(P<0.05)(圖1)。

2.3 兩地禾本科草本和非禾本科草本體內(nèi)草酸鈣含量對(duì)比

哈巴湖自然保護(hù)區(qū)的樣地為荒漠化草原，正藍(lán)旗的樣地為典型草原，兩地植被都是以草本為主。禾本科和非禾本科植物草酸鈣含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在哈巴湖自然保護(hù)區(qū)和正藍(lán)旗，非禾本科草本植物的草酸鈣含量均顯著高于禾本科草本(P<0.05)，而兩地間的差異不顯著(圖2)。

表1 半干旱區(qū)草原帶兩地植物體內(nèi)草酸鈣含量Table 1 Contents of calcium oxalate in plants of both vegetation zones in semi-arid area

續(xù)表1

圖1 寧夏哈巴湖和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗兩地C3植物和C4植物草酸鈣含量比較Fig.1 Comparison of calcium oxalate contents between C3 plants and C4 plants for the Ningxia Habahu National Nature Reserve and Zhenglan Qi County of Inner Mongolia注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

圖2 寧夏哈巴湖和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗兩地禾本科草本和非禾本科草本草酸鈣含量比較Fig. 2 Comparison of calcium oxalate contents between grass and herb in the Ningxia Habahu National Nature Reserve and Zhenglan banner of Inner Mongolia

3 討論

植物草酸鈣具有顯著的鈣庫(kù)功能和植物抗逆與植物防御功能[4,7,9]。草酸鈣含晶細(xì)胞多集中在沙生、旱生植物的葉和軸器官中，被認(rèn)為是荒漠植物抗旱結(jié)構(gòu)特征之一[10]。積累草酸鈣的晶異細(xì)胞具有較高的滲透勢(shì)，在水分狀況好時(shí)吸收貯存水分，在干旱的時(shí)候可以給周邊細(xì)胞提供較為濕潤(rùn)的小環(huán)境，增強(qiáng)抗旱性[10]。嚴(yán)巧娣等對(duì)幾種荒漠植物含晶細(xì)胞比較的研究表明[8]，草酸鈣晶體主要在柵欄組織、貯水組織和維管束中出現(xiàn)，而這正是Ca2+從土壤到根、莖、葉的運(yùn)輸通道，這一點(diǎn)也印證了草酸鈣晶體增強(qiáng)抗旱性的作用。本研究結(jié)果表明，寧夏哈巴湖和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗的沙生植物(如豬毛菜、沙蓬、蟲實(shí)、霧冰藜、尖頭葉藜)、旱生植物(如駝絨藜、駱駝蓬、荒漠錦雞兒、草原石頭花)和鹽生植物(如堿地膚、白刺)草酸鈣含量相對(duì)較高。這些植物都對(duì)干旱或鹽堿環(huán)境的適應(yīng)力很強(qiáng)，它們體內(nèi)積累的草酸鈣也許是使其能夠適應(yīng)或抵抗不良環(huán)境的原因之一，這說(shuō)明草酸鈣的積累是植物適應(yīng)環(huán)境的一種方式。一般來(lái)說(shuō)，降水越少，水分條件越差，植物抗旱性越強(qiáng)[25-27]。寧夏哈巴湖降水相對(duì)內(nèi)蒙古正藍(lán)旗較少，哈巴湖年均降水量296.5 mm，正藍(lán)旗年均降水量370.7 mm，哈巴湖植物草酸鈣含量最高的前十個(gè)值都比正藍(lán)旗相應(yīng)值要高。顯然，生境越干旱，植物體內(nèi)草酸鈣含量會(huì)越高。因此，可以認(rèn)為，草酸鈣含量越高，植物抗脅迫能力越強(qiáng)。

值得指出的是，植物體內(nèi)草酸鈣含量影響草本植物被牲畜取食的適口性。草酸鈣的形成對(duì)于某些植物來(lái)說(shuō)似乎是一種誘導(dǎo)的防御反應(yīng)[16]。Ward等[28]研究表明，全能花屬植物Pancratiumsickenbergeri只有葉片的尖端會(huì)遭到瞪羚(Gazelladorcas)啃食，而葉片尖端正是整個(gè)葉片中唯一沒(méi)有草酸鈣針晶的部分。Nakata發(fā)現(xiàn)，植物Tragiaramosa的刺毛里有草酸鈣針狀晶體，當(dāng)動(dòng)物接觸時(shí)，這些晶體釋放，刺穿動(dòng)物表皮，甚至注入毒素，影響動(dòng)物取食，起到自我保護(hù)的效果[29]。本研究結(jié)果表明，同屬半干旱區(qū)草原帶的寧夏哈巴湖和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗，均是禾本科草本的草酸鈣含量顯著低于非禾本科草本。在荒漠化草原帶的寧夏哈巴湖，禾本科草本的草酸鈣含量比非禾本科草本低56.37%；在典型草原帶的內(nèi)蒙古正藍(lán)旗，禾本科草本的草酸鈣含量比非禾本科草本低45.29%。在正藍(lán)旗，即使是禾本科草本植物，牲畜適口性好的糙隱子草、羊草、洽草、冰草、賴草等體內(nèi)草酸鈣含量很低，它們的草酸鈣含量分別是大針茅的5%，44%，48%，49%，51%，因此，在夏季牲畜不喜吃大針茅，而在冬季沒(méi)草了牲畜才吃大針茅，因而，大針茅表現(xiàn)出一定的耐牧性[30]。一般而言，牲畜較喜歡啃食禾本科植物，而禾本科植物體內(nèi)草酸鈣含量較少，可見(jiàn)，草原植物體內(nèi)的草酸鈣含量越多，對(duì)于草食動(dòng)物來(lái)說(shuō)適口性越差。

本研究結(jié)果表明，在寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗，C3植物體內(nèi)草酸鈣含量相對(duì)較低，而C4植物體內(nèi)草酸鈣含量相對(duì)較高。一般而言，陸地植被是由約95%的C3植物和5%的C4植物組成，而C4植物水分利用效率高于C3植物，CAM(Crassulacean acid metabolism景天酸代謝)植物具有最高的水分利用效率[24]。顯然，C3植物和C4植物光合途徑是植物長(zhǎng)期適應(yīng)自然的結(jié)果，草酸鈣含量的差異也是植物長(zhǎng)期適應(yīng)自然的結(jié)果。

在騰格里沙漠，多年生草本草酸鈣含量較低，一年生草本顯著偏高[19]。徐靜靜等[20]研究表明，在天津鹽漬化生境中，從喬木、灌木、藤本到草本，植物體內(nèi)鹽酸溶性鈣含量逐漸減少，草本植物鵝絨藤(Cynanchumchinense)和芍藥(Paeonialactiflora)體內(nèi)未鏡檢到草酸鈣晶體。本研究結(jié)果表明，多種一年生的藜科植物的草酸鈣含量較高。這個(gè)結(jié)果和先前的研究并沒(méi)有本質(zhì)上的不同。禾本科植物抵御干旱逆境的機(jī)理研究其實(shí)多偏重基因角度。而從形態(tài)上看，為了應(yīng)對(duì)干旱脅迫，禾本科草本會(huì)通過(guò)葉片萎蔫、卷曲等方式減少蒸發(fā)面積，通過(guò)增加維管束，加厚表皮細(xì)胞角質(zhì)層，增加細(xì)根量等保證植物體內(nèi)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸[31]。比起形成草酸鈣晶體，禾本科植物似乎更傾向于選擇形態(tài)變化，或者吸收Ca2+來(lái)抵抗輕度脅迫，這也是與長(zhǎng)年生活于干旱或鹽堿土地的藜科等植物不同的應(yīng)對(duì)策略。

4 結(jié)論

在半干旱區(qū)的寧夏哈巴湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和內(nèi)蒙古正藍(lán)旗，禾本科草本草酸鈣含量顯著低于非禾本科草本，牲畜相對(duì)更喜取食禾本科植物，顯然，草酸鈣含量的增多降低了植物被牲畜獵食的適口性，影響草食動(dòng)物的取食。兩地C3植物體內(nèi)草酸鈣含量均顯著低于C4植物體內(nèi)草酸鈣含量?？梢?jiàn)，草原植物體內(nèi)草酸鈣含量的多少是其長(zhǎng)期進(jìn)化適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。兩個(gè)草原類型間植物草酸鈣含量沒(méi)有顯著差異，可以推測(cè)同在半干旱區(qū)的不同草原類型可能有相似的生理特征。