張明敬，史 慧

（江蘇省連云港市畜牧獸醫(yī)站，江蘇 連云港 222001）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)食品的需求量越來(lái)越高，大量的養(yǎng)殖禽畜被送往動(dòng)物檢疫處，以往的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，運(yùn)行成本高，無(wú)法應(yīng)付逐日遞增的工作量。比如雞胚病毒分離法，大概需要3周時(shí)間才能出檢疫結(jié)果，大大降低了檢疫處的工作效率。熒光PCR自上個(gè)世界90年代末發(fā)展起來(lái)后，逐漸被應(yīng)用于禽流感的日常監(jiān)測(cè)中，熒光PCR比普通PCR的敏感度高約10倍，可最大程度檢測(cè)禽畜中的微量病毒。

1 檢測(cè)樣品

本文從當(dāng)?shù)氐母鞔笸涝讏?chǎng)進(jìn)行取樣，分別取普通雞肉10份、雞喉或泄殖腔拭子10份、雞鴨血清各10份、雞內(nèi)臟10份。為了避免在取樣過(guò)程中發(fā)生污染，樣本用滅菌棉拭子粘取后放入加有PBS的滅菌小離心管中，對(duì)樣本的采集均使用滅菌剪、滅菌刀，采集后將取得的樣本置于2～8℃，如果在24h后不能被檢測(cè)，則應(yīng)置于-50℃的環(huán)境中保存。

2 試劑

試劑包括通用熒光RT-PCR試劑盒、RNA提取液、禽流感病毒H5、H7、H9亞型熒光RT-PCR 試劑盒、DEPC水、Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶、異丙醇以及 75%乙醇、生理鹽水。

3 儀器

主要儀器有分析天平、熒光PCR擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器、BioBard Chrom4型熒光PCR儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)

3.1 試驗(yàn)方法

3.1.1 樣本處理 每份樣品分別處理。首先，組織樣品處理，每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約1g左右，使用手術(shù)剪剪碎后取0.02g置于研磨器中研磨至均勻的粉狀，加入1.5mL生理鹽水繼續(xù)研磨，直至研磨成均勻漿糊狀后再轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，8000轉(zhuǎn)速離心2min，取上清液100μL置于1.5mL滅菌離心管中。其次，進(jìn)行陰陽(yáng)對(duì)照處理，分別取100μL對(duì)照置于1.5mL滅菌離心管中。

3.1.2 病毒RNA的提取 （1）取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，靜置三到五分鐘。（2）將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)被堵塞住），13000轉(zhuǎn)速離心30s。（3）扔掉收集管中廢液，加入600μL洗液，13000轉(zhuǎn)速離心30s，此步驟做完后重復(fù)一遍，保證收集管中的雜質(zhì)被洗滌干凈。（4）扔掉收集管中的廢液，13000轉(zhuǎn)速空柱離心2min，徹底去除殘留的洗滌液。（5）將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向吸附柱中央加入洗脫液50μL，靜置1min，13000轉(zhuǎn)速離心30s，此時(shí)離心管中生成的液體就是我們需要的RNA模板。

3.1.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR操作 設(shè)被檢樣品、陰陽(yáng)對(duì)照總和為N，則試劑反應(yīng)體系配制基本如下：無(wú)菌無(wú)核酸酶水2.7（N+1）μL、RT-PCR 反應(yīng)液 10（N+1）μL、酶混合液 0.4（N+1）μL、熒光探針1.9（N+1）μL。將以上配制的反應(yīng)體系充分混合均勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各15μL。

分別取5μL模板RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，均勻并做好標(biāo)記，在熒光PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：45℃ 15min，95℃1min該循環(huán)一次；95℃5s，60℃ 35s該循環(huán)40次。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果

整體檢測(cè)的結(jié)果與真實(shí)結(jié)果相吻合，首先陽(yáng)性對(duì)照的Ct值小于30時(shí)報(bào)告的曲線(xiàn)圖有明顯的增長(zhǎng)期，陰性并無(wú)明顯的增長(zhǎng)曲線(xiàn)，被檢測(cè)的樣本Ct值大于30時(shí)，需重復(fù)檢測(cè)一次，如果數(shù)值仍有仍大于30，基本可將樣本判定為陰性，整個(gè)報(bào)告不存在假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象。

2006 年以前，我們掌握的禽流感檢測(cè)技術(shù)主要以血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行免疫抗體水平檢測(cè)為主，采用普通的PCR檢測(cè)技術(shù)也能完成禽流感的檢測(cè)，但是隨著后來(lái)“企業(yè)自檢、官方抽測(cè)”原則的實(shí)施，檢疫處推廣使用了科學(xué)、健康、快速的熒光PCR，這種方式的優(yōu)點(diǎn)顯著，但同時(shí)也要注意配套措施和監(jiān)督的作用，為了提高熒光PCR的檢測(cè)效率，要做到以下幾方面，首先工作人員要嚴(yán)格操作，多利用通風(fēng)設(shè)備，避免樣本對(duì)儀器的污染。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上，我們不難發(fā)現(xiàn)，熒光PCR在禽流感檢測(cè)中的作用很重要，隨著人們對(duì)食品安全的重視，檢疫處必須加強(qiáng)禽流感的檢測(cè)，規(guī)范檢測(cè)步驟，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)，以耐心細(xì)心的工作態(tài)度為群眾提供一個(gè)良好的食品安全環(huán)境。

[1] 宋建領(lǐng)，等.禽流感實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].2014.

[2] 廖明.禽流感現(xiàn)狀對(duì)養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)的影響[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].2014.