哈斯來提阿依·買買提 胡昕 齊曼古力·吾守爾

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的危害人類身心健康的呼吸道傳染性疾病[1]。WHO[2]在《2017年全球結核病報告》中指出，全球新增結核病患者1040萬例，死亡患者達170萬例，結核病成為了全球第九大致死性疾病[3]。近幾年，隨著耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的暴發(fā)流行，結核病并發(fā)HIV感染者增多，使我國結核病疫情再度回升。據(jù)WHO[2]估算，2017年全球MDR-TB新發(fā)患者約49萬例；我國作為全球27個MDR-TB高負擔國家[4]，新發(fā)MDR-TB患者例數(shù)僅次于印度[2]。因此，早期發(fā)現(xiàn)、干預、治療依舊是我國控制結核病工作的重點。

結核病診斷方法及血清蛋白質組學來源

一、常用結核病診斷方法

結核病常用診斷方法有實驗室檢查法，如痰涂片法；此方法雖操作簡單、廉價，但陽性率僅為20%～30%[5]。相比之下，痰培養(yǎng)成了診斷結核病的金標準，提供了比痰涂片更高的陽性率(30%～40%)[5]；但培養(yǎng)耗時較長，不能用于結核病的早期、快速診斷。結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD)試驗，在診斷結核病中漏診率可達18.3%[6]；甚至在遲發(fā)型變態(tài)反應、免疫力低下、應用免疫抑制劑、百日咳、麻風等患者中可出現(xiàn)假陰性[7]。影像學檢查法，如X線胸部攝影，對于微小病灶檢出率低，胸部CT檢查能彌補以上缺陷，被看作診斷結核病常用的檢查手段而廣泛使用。因結核病病灶在影像學上表現(xiàn)多樣化，容易與肺炎、慢性阻塞性肺疾病等混淆。分子生物學檢查，如熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorosence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)法[8]，其陰性預測值只有49.1%。因此，迫切需要找出既快速又準確的結核病診斷方法。

二、血清蛋白質組學來源

隨著生物學技術的發(fā)展，研究者們將結核病診斷的重點開始轉向能反映機體狀態(tài)的蛋白質組學研究。1991年Nagai 等[9]首次應用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技術，對MTB H37Rv菌株2～10周培養(yǎng)濾液中的蛋白質進行分離鑒定，拉開了MTB蛋白質組學研究的序幕。其中，同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative absolute quantitation，iTRAQ)結合二維液相色譜-串聯(lián)質譜技術(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2DLC-MS/MS)，即iTRAQ-2DLC-MS/MS技術因分離能力強、分析范圍廣、敏感度高、特異度高、自動化程度高等諸多優(yōu)點，受到研究人員關注并逐漸得到廣泛使用。

血清蛋白質組學概述

血清蛋白質組學本質上是指在大規(guī)模水平上研究血清中蛋白質特征的一門學科。當機體受刺激或生理功能發(fā)生變化時，血清蛋白也隨著出現(xiàn)相應變化。血清蛋白質組學作為一種整體、動態(tài)、定性、定量、全面分析蛋白質的功能、組成及相互關系的一門學科，發(fā)現(xiàn)與疾病相關的血清蛋白標志物有重大意義。Li等[10]運用iTRAQ技術[11]聯(lián)合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜[12](matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術來研究結核病患者和健康人群血清標本，發(fā)現(xiàn)性激素結合球蛋白(sex hormone binding globulin，SHBG)可作為結核病潛在診斷性血清學標志物。Wang等[13]運用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術研究發(fā)現(xiàn)，CD44、激肽原1重組蛋白(recombinant kininogen 1,KNG1)含量在MDR-TB患者血清中明顯升高，可作為診斷MDR-TB潛在的血清蛋白標志物。其中，iTRAQ-2DLC-MS/MS技術因分離能力強、分析范圍廣、敏感度高、特異度高、檢測限低、自動化程度高等諸多優(yōu)點，受到研究人員的關注并使用。

iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白質組學技術原理

iTRAQ-2DLC-MS/MS技術是指將iTRAQ與2DLC-MS/MS技術相聯(lián)用，用核素標簽的方法對復雜組分的蛋白樣本進行分析研究的新型技術。其基本原理是先根據(jù)TRAQ[14]技術原理將試劑與賴氨酸側鏈或肽段的N端發(fā)生反應，完成對肽段的標記，然后再利用2DLC-MS/MS[15]技術將血清樣品分子進行離子化，并根據(jù)質荷比差異來分離，最終得到蛋白質的相對分子質量。其中TRAQ技術可標記相對分子質量8000～280 000(8～280 kD)[16]的蛋白，甚至可靈敏地檢測跨膜蛋白，被用于研究宮頸癌[17]、口腔鱗狀細胞癌[18]、肝細胞癌[19]等多種疾病的生物標志物。2DLC-MS/MS[15]技術可對肽及蛋白質的氨基酸序列及相對分子質量進行準確的測量，并分析蛋白質翻譯后的修飾過程。當同位素標記與質譜技術聯(lián)用時，信號離子表現(xiàn)為不同質荷比的峰，根據(jù)峰值可得到蛋白質的定量信息[20]，不僅定量結果精確，且穩(wěn)定性好[21]，非常適合對多樣本進行平行分析，應用于HIV并發(fā)肺結核[22]、前列腺癌[23]等多種疾病血清蛋白標志物的研究。

iTRAQ-2DLC-MS/MS技術在結核病血清蛋白質組學中的研究和應用

疾病的發(fā)生和發(fā)展涉及蛋白質水平的變化。MTB感染可通過多種途徑在血液循環(huán)中引起結核病相關蛋白的變化。因此，血清蛋白也可以反映結核病患者的病理狀態(tài)。因這些特點，越來越多的學者開始尋找結核病相關血清蛋白標志物，以提高結核病的診斷準確率。

一、iTRAQ-2DLC-MS/MS技術在結核病診斷中的應用

目前，iTRAQ-2DLC-MS/MS技術因較高的敏感度及特異度被眾多研究者們關注。江婷婷[16]研究選取了136例肺結核患者及66名健康人群血清標本，進行脫鹽、濃縮、還原、消化等處理后，用iTRAQ同位素標記聯(lián)合2DLC-MS/MS技術對樣本進行分析，最終選取維生素K依賴蛋白Z(human vitamin K-dependent protein Z，PROZ)、淀粉樣蛋白A(serum amyloid protein A，SAA)和C4b結合蛋白β鏈(human C4b-binding protein beta chain，C4BPB)等在肺結核與健康人群血清中表達差異的蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法對差異蛋白行后續(xù)驗證，構建含有驗證蛋白質的結核病決策樹。得出該診斷模型的準確率為97.2%，敏感度為97.06%，特異度為95.45%。因此，認為SAA、PROZ和C4BPB可能是肺結核的新型潛在診斷性生物標志物。Xu等[24]將結核病患者及健康人血清進行iTRAQ-2DLC-MS/MS分析比較，獲得載脂蛋白II(apolipoprotein II，APOCII)、人CD5分子樣蛋白(human CD5 molecular protein，CD5L)、重組人視黃醇結合蛋白(recombinant human retinol binding protein，RBP4)等兩組人群血清中表達差異的蛋白。以蛋白質構建最優(yōu)分類樹診斷模型，該模型篩檢的敏感度、特異度分別為93.42%、92.86%，對于結核病的診斷有一定的參考價值。

二、iTRAQ-2DLC-MS/MS技術在結核病及其他肺部疾病鑒別中的應用

肺炎和慢性阻塞性肺疾病也可能出現(xiàn)與活動性肺結核相似的常見癥狀，如胸痛、咳痰、發(fā)熱和盜汗等。當痰涂片陰性時，痰培養(yǎng)成為主要診斷方法，但其所需時間長(約需4～8周)。盡管近年來核酸擴增技術已被開發(fā)用于診斷結核病，但使用該技術時，在支氣管癌患者和有結核病病史的個體中發(fā)現(xiàn)了假陽性結果[11]。為了解決這些缺陷，Xu等[25]運用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術分析、篩選和鑒定結核病、肺炎、肺癌患者及健康人血清標本，最終發(fā)現(xiàn)基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、鈣粒蛋白(calcareous protein，S100A9)和胞外超氧化歧化酶重組蛋白(extracellular superoxide dismutase recombinant protein，SOD3)含量在結核病患者血清中明顯升高。用三者建立診斷模型，可將結核病與肺炎、肺癌鑒別開來。該模型鑒別結核病與肺炎、結核病與肺癌患者的敏感度分別為90%、85%。特異度分別為87.05%、90.05%；江婷婷[16]報告，采用上述技術鑒定和分析初治活動性肺結核、肺炎、慢性阻塞性肺疾病患者血清標本，并將篩檢出的SAA、PROZ、C4BPB表達差異的蛋白組成決策樹，該模型鑒別診斷初治肺結核與肺炎的準確度為85.2%，敏感度為95.60%，特異度為71.40%；與慢性阻塞性肺疾病鑒別的準確度為69.30%，敏感度為100.00%，特異度為72.50%。最終認為，三者可能是結核病潛在的血清生物學標志物，同時利用上述標記物可以鑒別結核病及其他肺部疾病。

三、iTRAQ-2DLC-MS/MS技術在結核病發(fā)展過程中的應用

血清蛋白標志物可能參與結核病患者潛伏期、活動期、轉歸期過程。血清或血漿蛋白水平的微量變化可提示機體是否處于MTB潛伏感染狀態(tài)?；顒有越Y核病患者病灶處于開放狀態(tài)，MTB繁殖活躍、毒力強。Xu等[24]應用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術，分析活動性肺結核患者及健康人血清蛋白，最終獲得載脂蛋白cⅡ、類 CD5 抗原、透明質酸結合蛋白2、視黃醇結合蛋白4、血清淀粉樣蛋白 A4和血漿酶原結合蛋白等血清蛋白標志物；Wang等[26]對規(guī)律抗結核治療后患者及健康對照組血清進行分析，最終發(fā)現(xiàn)蛋白、解離抑制因子β、補體C3、纖維黏膠蛋白2、脂蛋白a水平較健康人群顯著升高，認為這5種蛋白可能是治療后結核病患者的血清蛋白標志物。

結 論

結核病作為古老的傳染性疾病，早期發(fā)現(xiàn)和診斷依然是有效控制結核病的首要任務。血清蛋白質組學以高敏感度和特異度開始受國內(nèi)外學者關注。結核病血清蛋白質組學研究結果初步顯示，運用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術鑒定、分析結核病相關血清蛋白標志物，對診斷結核病具有較高的敏感度和特異度。當然這些特異血清蛋白標志物在不同類型結核病患者血清中表達水平有無差異，需要進行更深層次的研究。不可忽視的是，檢測血清中結核病有關差異蛋白雖然具有高的敏感度和特異度，但是距離臨床應用還需要很長一段時間，需要科學工作者不斷印證并探索新型技術。目前iTRAQ-2DLC-MS/MS技術及有關肺外結核及其他傳染性疾病應用血清蛋白質組學的研究極少，這就需要科學工作者不斷探索更多肺外結核的相關標志物，以確定肺結核與肺外結核蛋白標記物有無差異，明確兩者之間有無關系。同樣，作為呼吸道傳染性疾病，血清蛋白標志物與其他傳染性疾病之間有無關聯(lián)性，也有待做進一步探索。