張玲秀， 白建華， 郝瑞林， 董社琴

(忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州 034000)

隨著地球人口的不斷增加和人們對(duì)生活水平的不斷追求，人們對(duì)糧食產(chǎn)量的增加也提出了更高的要求，現(xiàn)在各國都在大力開發(fā)和實(shí)施綠色環(huán)保農(nóng)業(yè)。玉米作為全球主要糧食和飼料作物之一，其產(chǎn)量的提高具有重要意義。

在4億年前，共生土壤真菌協(xié)助陸地植物在地球繁殖，兩者形成互利的關(guān)系。根部定殖真菌的共生對(duì)植物的適應(yīng)、獲取營養(yǎng)和對(duì)生物和非生物的協(xié)迫具有重要作用。印度梨形孢(Pirifomosporaindica)被發(fā)現(xiàn)于印度西北部沙漠地區(qū)的灌木叢根部，主要由菌絲與孢子組成，其孢子形狀類似于梨形，根據(jù)其發(fā)現(xiàn)地與形態(tài)特征，將其命名為印度梨形孢。該菌屬于擔(dān)子菌門層菌綱梨形孢屬[1]。印度梨形孢可在植物根部定殖，并隨著根部的成熟，定殖量不斷增加。印度梨形孢在植物中的定殖過程包括3個(gè)階段：與植物之間相互識(shí)別開啟共生模式、定殖于植物進(jìn)行活體營養(yǎng)階段、干擾植物細(xì)胞死亡程序形成共生關(guān)系。印度梨形孢與植物互作具有以下生物學(xué)功能：促進(jìn)植物生長、提高植物抗逆境脅迫能力、提高植物抗生物逆境能力等[1]。

印度梨形孢是一種具有廣泛宿主的植物內(nèi)生真菌[2]。它能促進(jìn)植物的生長和提高產(chǎn)量，可提高植物對(duì)營養(yǎng)的吸收和對(duì)生物和非生物的脅迫，如抵抗干旱和水澇[3-4]。能夠誘發(fā)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，顯著提高植物對(duì)多種病害的抗病性，減輕發(fā)病水平[5]，因而印度梨形孢定殖后能提高植株的系統(tǒng)抗病性和抗逆性。

印度梨形孢可在人工培養(yǎng)基上生長并能順利完成其生活史，這一性狀使其商品化開發(fā)應(yīng)用成為可能，更具商業(yè)開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景[6]。將印度梨形孢作為生物菌肥可以更好地為農(nóng)業(yè)發(fā)展作貢獻(xiàn)，然而印度梨形孢發(fā)酵生產(chǎn)菌肥的工藝和菌肥田間應(yīng)用試驗(yàn)鮮有報(bào)道。

本研究首先對(duì)印度梨形孢進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化擴(kuò)大培養(yǎng)菌肥，進(jìn)而施用于大田玉米種子、3葉期、5葉期等時(shí)期，并對(duì)印度梨形孢定殖于玉米根部進(jìn)行檢測，最后測定玉米生物總鮮質(zhì)量、玉米產(chǎn)量，確定其對(duì)玉米生長量的影響。本研究能為印度梨形孢菌肥應(yīng)用于大田玉米生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

印度梨形孢(Piriformosporaindica)保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。供試玉米品種為先玉335，種子購買于市場。

1.2 方法

1.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)通過前期單因素優(yōu)化結(jié)果，選取影響顯著的3個(gè)因素：A(初始pH值)、B(培養(yǎng)溫度)、C(轉(zhuǎn)速)，以印度梨形孢生物量(以D600 nm表示)為指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

1.2.2 印度梨形孢共生玉米根形態(tài)學(xué)觀察及真菌18S rDNA擴(kuò)增鑒定 在玉米生長的7葉期，隨機(jī)選取玉米根系，用自來水沖洗干凈后再用蒸餾水沖洗3遍，剪成1 cm長的小段，經(jīng)10% NaOH浸泡4 h后洗凈，再經(jīng)1% HCl浸泡5 min后洗凈，最后用0.05%乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色制片，于體視顯微鏡下觀察印度梨形孢真菌定殖情況并拍照[7]。

另外，取玉米7葉期根系，用蒸餾水沖洗、乙醇消毒3遍后，采用十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethy ammonium bromide，簡稱CTAB法)提取總DNA，PCR擴(kuò)增引物為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 印度梨形孢大田施肥及玉米生物量和產(chǎn)量的測定 農(nóng)田選取地點(diǎn)為山西省忻州市定襄縣宏道鎮(zhèn)東街村，種植時(shí)間為2016年4月22日，種植數(shù)量為120株，分成3組：陽性對(duì)照、根部灌菌、種子拌菌+根部灌菌，每組40株，陰性對(duì)照不作處理，種子拌菌組在種植前將種子浸泡菌液；玉米在3葉期和5葉期進(jìn)行2次根部澆灌稀釋菌液，收獲玉米后稱各區(qū)玉米總鮮質(zhì)量、玉米棒質(zhì)量，測量株高和葉長，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 以pH值、溫度、轉(zhuǎn)速為自變量，以印度梨形孢菌液600 nm處的吸光度為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施結(jié)果見表2。

2.1.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析 根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert v8.0.5.b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得主要分析結(jié)果見表3。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，因素B(溫度)對(duì)印度梨形孢生物量影響效果的線性效應(yīng)顯著，因素A(pH值)和C(轉(zhuǎn)速)效應(yīng)不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)結(jié)果的曲面效應(yīng)顯著，因素AB、AC交互影響效應(yīng)顯著。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多次擬合回歸，以梨形孢生物量(Y)為因變量，初始pH值(A)、溫度(B)、轉(zhuǎn)速(C)為自變量建立回歸方程模型為Y=0.570-0.010A-0.046B-0.018C-0.060AB-0.051AC+0.038BC-0.082A2-0.130B2-0.072C2。

表2 印度梨形孢響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

另外，由表3可知，試驗(yàn)因素對(duì)印度梨形孢生物量影響顯著程度由大到小依次為溫度>轉(zhuǎn)速>初始pH值。模型的回歸F值為12.93，P=0.001 4，表明該模型在0.01水平上顯著。多元相關(guān)系數(shù)R2=0.983 2，調(diào)整R2=0.960 3，表明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，失擬項(xiàng)差異不顯著(P=0.227 7>0.05)，表示該方程試驗(yàn)擬合效果好。

表3 回歸與方差分析結(jié)果

2.1.3 響應(yīng)面圖及等高線圖分析 根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面和等高線，結(jié)果見圖1、圖2、圖3。響應(yīng)面和等高線均可闡明該模型。在響應(yīng)面中，單因素影響效果與曲面陡峭相關(guān)，曲面越陡峭，影響越顯著。等高線與響應(yīng)面相對(duì)應(yīng)，響應(yīng)值越大曲線越接近中心。各因素交互作用與等高線形狀相關(guān)，圓形則為不顯著，橢圓為顯著。

通過Design Expert v8.0.5.b軟件進(jìn)行分析，印度梨形孢生物量的最佳培養(yǎng)條件是初始pH值為6.02、培養(yǎng)溫度為27.55 ℃、轉(zhuǎn)速為178.2 r/min，此條件下菌體D600 nm的理論值為0.625 9。在該條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，菌體D600 nm平均值為0.612 9，與預(yù)測值的誤差僅為2.07%，表明該模型可靠性高，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化印度梨形孢的培養(yǎng)條件是可行的。

2.2 印度梨形孢共生玉米根形態(tài)學(xué)觀察及真菌18S rDNA擴(kuò)增鑒定

2.2.1 印度梨形孢共生玉米根形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 在玉米生長的7葉期，選取印度梨形孢真菌與玉米共生根系，經(jīng)苔盼藍(lán)染色，在6.3×25體視顯微鏡下可清晰地觀察到該真菌在紫根部的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)非常密集地定殖有橢圓形的厚垣孢子，主要在根系成熟區(qū)的表皮層，分生區(qū)、伸長區(qū)少有定殖。如圖4箭頭所示。

由圖4可知，印度梨形孢主要定殖在植物根系的表皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間形成致密的菌絲組織。在定殖過程中，首先由附著在植物根部表皮的厚垣孢子萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，緊接著萌發(fā)自不同孢子的菌絲迅速聯(lián)接起來，在根表形成菌絲網(wǎng)絡(luò)，孢子萌發(fā)后菌絲穿透根部表皮細(xì)胞壁或通過細(xì)胞間隙進(jìn)入根組織內(nèi)部。

2.2.2 通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增結(jié)果 以提取的所有供試真菌DNA為模板，用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增的rDNA ITS，電泳圖譜顯示擴(kuò)增出的片段大約380 bp，可確定的確有真菌存在于植物根系，另從分子大小初步判斷其為印度梨形孢浸染玉米根部。結(jié)果見圖5。

2.3 印度梨形孢大田施用及玉米生物量和產(chǎn)量的測定

印度梨形孢對(duì)供試玉米(先玉335)植株的生長有顯著性影響。玉米在生長各時(shí)期株高均顯著高于對(duì)照，接種印度梨形孢的玉米具有較長的主根，更綠、更寬的葉片，更粗壯的莖稈，更多量的生物總量和玉米產(chǎn)量。

由表4可知，從種子拌菌到3葉期和5葉期菌液澆灌，與對(duì)照相比，拌種加灌菌處理下，玉米生物量增加25%；玉米鮮質(zhì)量增加38%； 3葉期平均主根長增加26%；株高增加9%；葉長增加17%。灌菌處理下，玉米生物量增加6%；玉米鮮質(zhì)量增加18%；3葉期平均主根長增加15%；株高增加7%；葉長增加4%。可見印度梨形孢可顯著促進(jìn)玉米的生長和提高產(chǎn)量，其中拌種加灌菌效果更明顯。印度梨形孢可伴隨玉米種子的萌發(fā)而定殖于根部，后期的根部澆灌也具有同樣的效果。施印度梨形孢菌肥宜在早期，促進(jìn)效果更佳。

關(guān)于印度梨形孢促進(jìn)玉米生長發(fā)育的機(jī)制可能涉及到激素和營養(yǎng)吸收等方面，另外對(duì)玉米干旱等逆境下所起的有益作用，也可能間接促進(jìn)生物量和產(chǎn)量的增加，這方面有待進(jìn)一步研究。

表4 印度梨形孢對(duì)大田玉米生物量、產(chǎn)量和主根長的影響

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生真菌印度梨形孢可進(jìn)行離體培養(yǎng)，易于規(guī)?；苿┑闹苽?，寄主范圍更加廣泛，具有廣譜生物學(xué)效應(yīng)特性。在生物功能上，印度梨形孢與叢枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi，簡稱AMF)極為相似，能促進(jìn)植物生長，加快植物對(duì)氮、磷等礦物質(zhì)的吸收，提高作物對(duì)逆境脅迫的忍耐性，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。但AMF不能進(jìn)行純培養(yǎng)，而印度梨形孢可以在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。自印度梨形孢被發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于該菌的寄主，該菌促進(jìn)植物生長、提高植物抗逆抗病性、增加植物產(chǎn)量、提高果實(shí)品質(zhì)等的研究報(bào)道層出不窮。近年來，廣大科研人員側(cè)重于印度梨形孢與植物互作分子機(jī)制的研究。這些研究主要來源于德國、印度等首次報(bào)道該菌的國家以及伊朗、墨西哥、美國等后來才逐漸開始研究該菌的國家。目前，國內(nèi)浙江大學(xué)、福建農(nóng)林大學(xué)的相關(guān)科研人員也在進(jìn)行研究，但所做發(fā)酵優(yōu)化并不全面，且未見將印度梨形孢開發(fā)制備成生物肥料和應(yīng)用于玉米大田的研究報(bào)道[1，3，6]。

本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用響應(yīng)面法優(yōu)化印度梨形孢發(fā)酵技術(shù)參數(shù)為pH值6.02、培養(yǎng)溫度 27.55 ℃、轉(zhuǎn)速178.2 r/min。在此條件下，提高了菌體生物量，為印度梨形孢應(yīng)用于大田實(shí)踐奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)一步可將印度梨形孢制備成綠色、安全、無污染的抗逆、促生型生物肥料，解決長期以來不合理施用化肥造成的土壤板結(jié)、環(huán)境污染等問題，彌補(bǔ)現(xiàn)有的各種生物肥料施用范圍局限、肥效不穩(wěn)定等缺陷，為發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)提供一條新途徑。