高敏敏， 稅典章， 吳 萍， 葉元土， 吳 韜， 何冬成， 陳 卓， 崔振華

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123； 2.無錫三智生物科技有限公司，江蘇無錫 214000；3.華辰水產(chǎn)有限公司，江蘇鹽城 224000； 4.林華水產(chǎn)有限公司，江蘇鹽城 224000)

異育銀鯽鰓出血病是由鯉皰疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)引發(fā)的一種危害非常大的流行性病毒性疾病。關(guān)于CyHV-2的傳播途徑尚不完全清楚，一種可能性是通過魚卵、受精卵到魚苗的縱向傳播途徑，另一種可能途徑是通過魚體體表黏液在魚體之間的橫向傳播途徑?？v向傳播途徑的研究需要在魚卵、受精卵中找到CyHV-2存在和傳播的路徑，而橫向傳播則需要在魚體體表黏液中找到CyHV-2存在的證據(jù)和傳播路徑。

本研究以發(fā)生異育銀鯽鰓出血病的單一池塘為研究單位，以同一池塘中的不同魚類、異育銀鯽魚體的體表黏液、魚卵巢、水體、水體中藻類等為試驗材料，采用定量PCR方法檢測CyHV-2的特異性存在，評價在池塘環(huán)境條件下不同魚體、雌性魚體卵巢、魚體體表黏液、浮游生物中是否攜帶CyHV-2，探討CyHV-2在池塘環(huán)境中的傳播途徑、存在狀態(tài)，以期為系統(tǒng)防控異育銀鯽鰓出血病的發(fā)生和發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣池塘

選擇江蘇大豐的上海農(nóng)場(光明漁業(yè)公司)的8號、17號池塘和大豐葦漁場的9號、18號池塘(鹽城華辰水產(chǎn)科技有限公司)共4個池塘為試驗對象，這4個池塘在2017年6月初均有疑似異育銀鯽鰓出血病發(fā)生。于2017年6月23、24日分別對這4個池塘的異育銀鯽、草魚、鰱鳙魚、野雜魚和浮游生物進行采樣，進行CyHV-2檢測。

1.2 魚體材料

魚種類：選擇池塘中異育銀鯽、草魚、鰱魚、鳙魚、野雜魚等種類，將魚體在冰盤上解剖，取肝、胰、脾、腎等內(nèi)臟，每尾魚的肝臟、胰臟、脾臟、腎臟混合為1個樣本，液氮速凍后帶回蘇州大學(xué)實驗室用于檢測CyHV-2。如果鯽魚性成熟，則采集魚卵、或精巢進行CyHV-2檢測。鯽魚體表黏液通過刮取鯽魚體表兩側(cè)提取，液氮冷凍保存于CyHV-2檢測。

1.3 浮游生物樣本

取池塘飼料投喂區(qū)域、水面下30 cm水樣，用80目濾網(wǎng)過濾，濾渣再經(jīng)過3 000 r/min離心10 min，得沉淀物液氮速凍作為池塘浮游生物樣本用于CyHV-2檢測。

1.4 CyHV-2檢測方法

以CyHV-2病毒核心序列C-2-F1和C-2-R1為引物(C-2-F1：TGGAATCAGTTCAACGCGTCAT；C-2-R1：CGTCAGTGCCTGGCAGTAATA)，提取樣品組織的DNA為模板，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖進行凝膠電泳。電泳圖譜中239 bp片段特異性條帶即為CyHV-2病毒陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海農(nóng)場水產(chǎn)養(yǎng)殖四區(qū)17號池塘(NC-4-17)CyHV-2檢測結(jié)果

上海農(nóng)場水產(chǎn)養(yǎng)殖四區(qū)17號(編號：NC-4-17)池塘面積4 hm2，魚種放養(yǎng)模式為：體質(zhì)量131.5 g/尾的異育銀鯽 38 671尾/hm2；255 g/尾的鰱魚836尾/hm2；體質(zhì)量862 g/尾的鳙魚896尾/hm2。魚種放養(yǎng)時間為2016年2月27日。2017年6月初，異育銀鯽開始發(fā)病，診斷為鰓出血病，于2017年6月25日采樣，異育銀鯽累計死亡約3 000尾，采樣時還有鯽魚死亡情況。以收撒網(wǎng)采集池塘中6尾異育鯽魚的肝胰脾腎混合物樣品、6尾異良銀鯽的體表黏液；1號、4號鯽魚為雌性(其余為雄性)，采集了卵巢樣品。

由圖1可知，該池塘異育銀鯽發(fā)生了典型的鰓出血病，取樣的1～6號異育銀鯽的肝、胰、脾臟和腎混合物中在239 bp出現(xiàn)明顯的條帶，顯示CyHV-2的存在，也證實了該池塘發(fā)生的疾病為異育銀鯽鰓出血病。重要的是，在其黏液中檢測到了CyHV-2，在1號、4號(其他為雄性個體)異育銀鯽魚卵中也檢測到了CyHV-2。結(jié)果表明，對于已經(jīng)發(fā)病的異育銀鯽個體，其體表黏液含有CyHV-2，可以成為橫向(魚體個體之間)傳播的基礎(chǔ)，即魚體之間通過身體黏液的接觸傳播CyHV-2是可能的。同時，魚卵中CyHV-2的存在，也預(yù)示著通過魚卵傳遞到受精卵中的可能性。

2.2 上海農(nóng)場水產(chǎn)養(yǎng)殖一區(qū)8號池塘(NC-1-8)CyHV-2檢測結(jié)果

NC-1-8池塘是1個異育銀鯽鰓出血病發(fā)病池塘，在取樣1～6號異育銀鯽肝、胰、脾、腎的混合樣品中，在239 bp出現(xiàn)明顯的條帶，顯示CyHV-2的存在；同時，1～6號鯽魚體表黏液中也檢測到了CyHV-2的存在。在2、6號鯽魚魚卵中也檢測到CyHV-2的存在。結(jié)果表明，NC-1-8池塘的異育銀鯽發(fā)生了CyHV-2病，鯽魚肝、胰、脾、腎混合樣品中檢測到了CyHV-2；同時，鯽魚體表黏液中CyHV-2的存在，預(yù)示著魚體之間橫向傳播CyHV-2的可能性；魚卵中 CyHV-2 的存在預(yù)示著通過受精卵縱向傳播CyHV-2的可能性。

2.3 大豐葦漁場18號池塘(DFW-18)CyHV-2檢測結(jié)果

該池塘面積5.2 hm2，魚種放養(yǎng)模式為：異育銀鯽：體質(zhì)量 8 g/尾 的魚種20 507尾/hm2、體質(zhì)量161 g/尾的魚種 7 463尾/hm2；體質(zhì)量7 g/尾的草魚149 254尾/hm2；體質(zhì)量 13 g/尾 的鰱魚597尾/hm2；體質(zhì)量18 g/尾的鳙魚 1 239尾/hm2。魚種放養(yǎng)時間為2017年3月10日，2017年6月初異育銀鯽開始有少量死亡，于2017年6月24日采樣，異育銀鯽累計死亡1 000尾。采樣時該池塘發(fā)病得到有效控制，沒有再出現(xiàn)鯽魚死亡情況。采集了10尾鯽魚的肝脾腎混合物樣和體表黏液；同時采集有草魚、鰱魚、鳙魚、野雜魚的肝脾腎混合樣；采集浮游生物樣品1個。

DFW-18池塘不同魚種、浮游生物中CyHV-2的檢測結(jié)果見圖3和圖4。

由圖3可知，DFW-18池塘中，異育銀鯽1、2、3、4、5號個體帶有239 bp的CyHV-2條帶，其他個體的不明顯；1、4、5、6、7、8、10號鯽魚的體表黏液有239 bp的CyHV-2條帶但不明顯。DFW-18池塘的異育銀鯽內(nèi)臟中有CyHV-2的存在，但239 bp條帶的明亮程度不強；異育銀鯽的體表黏液中也有CyHV-2的存在。

由圖4可知，異育銀鯽的卵巢、精巢中沒有檢測到明顯的239 bp的CyHV-2特異條帶。鰱魚2號肝脾腎混合樣中檢測到239 bp的CyHV-2條帶，而草魚、鳙魚和野雜魚中沒有檢測到239bp的CyHV-2條帶；浮游生物樣中也沒有檢測到239 bp的CyHV-2條帶。這個結(jié)果表明，在DFW-18池塘中，除了異育銀鯽內(nèi)臟和黏液中攜帶239 bp的 CyHV-2條帶外，鰱魚的個體可能有239 bp的CyHV-2條帶，而其他魚種沒有239 bp的CyHV-2條帶。

2.4 大豐葦漁場9號池塘(DFW-9)CyHV-2檢測結(jié)果

該池塘面積9.2 hm2，魚種放養(yǎng)模式為：體質(zhì)量76 g/尾的異育銀鯽12 716尾/hm2；體質(zhì)量63 g/尾的草魚 37 313尾/hm2；體質(zhì)量455 g/尾的鰱魚776尾/hm2；體質(zhì)量556 g/尾的鳙魚761尾/hm2。魚種放養(yǎng)時間為2017年3月6日，2017年6月初異育銀鯽開始有少量死亡，于2017年6月24日采樣，鯽魚累計死亡1 500尾，采樣時不再有鯽魚死亡情況。采集了10尾異育鯽魚的肝脾腎混合物樣、體表黏液和卵巢樣品；同時采集浮游生物樣品1個。

由圖5可知，DFW-9池塘的異育銀鯽檢測樣本中，4、9、10號鯽魚的肝脾腎混合樣中有明顯的239 bp的CyHV-2條帶，其他個體不明顯；而1～10號鯽魚的體表黏液中均有較為明顯的239 bp CyHV-2條帶。這一結(jié)果再一次證實了異育銀鯽體表黏液有CyHV-2的存在。

由圖6可知，在內(nèi)臟和體表黏液中有CyHV-2存在的情況下，異育銀鯽卵巢中沒有檢測到CyHV-2。池塘浮游生物中也沒有檢測到CyHV-2的存在。

3 討論

筆者所在課題組前期的研究結(jié)果表明，在發(fā)生鰓出血病的異育銀鯽體內(nèi)存在大量的CyHV-2粒子，在血液、肝、胰、腎、脾臟等組織中均有CyHV-2粒子的存在，也觀察到了CyHV-2粒子的成熟過程[1-3]。這些研究結(jié)果表明，CyHV-2是鯽魚鰓出血病的病原體，CyHV-2的增殖導(dǎo)致細(xì)胞破裂、死亡，魚體體內(nèi)、尤其是鰓小片大量出血，魚體發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)。

本研究以4個發(fā)生異育銀鯽鰓出血病的池塘為研究對象，對池塘中魚體內(nèi)臟、卵巢、黏液中CyHV-2的檢測結(jié)果顯示，在異育銀鯽發(fā)生CyHV-2病后，其肝臟、胰臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟器官組織中有CyHV-2的存在，也證實了這些池塘發(fā)生鯽魚死亡的疾病為CyHV-2病。

在4個目標(biāo)池塘中異育銀鯽體表黏液中CyHV-2的檢測結(jié)果顯示，鯽魚體表黏液中有CyHV-2的存在。這個結(jié)果表明，如果在體表黏液中含有CyHV-2，魚體之間通過身體的接觸，例如在攝食飼料的過程中，存在通過體表黏液傳播CyHV-2的可能性。當(dāng)然，本試驗僅證實發(fā)病鯽魚體表黏液中CyHV-2的存在，還不能完全證實通過體表黏液傳播CyHV-2的路徑、發(fā)生過程。

異育銀鯽魚卵中CyHV-2的存在，也證實了通過魚卵、受精卵傳播CyHV-2到魚苗的可能性。當(dāng)然，本研究結(jié)果僅是證實魚卵中CyHV-2存在的客觀性，這需要有更為精確的試驗來證實這種縱向傳播CyHV-2的路徑。

在鯽魚以外的其他種類中，僅有DFW-9池塘中鰱魚內(nèi)臟中檢測到了CyHV-2存在，而在其他種類如草魚、鳙魚和野雜魚中沒有檢測到CyHV-2。這提示通過其他種類傳播CyHV-2的可能性。

對2個池塘的浮游生物進行了CyHV-2檢測，均未檢測

到CyHV-2的存在，顯示通過浮游生物傳播CyHV-2的途徑可能是不存在的。

綜合本試驗結(jié)果表明，CyHV-2的傳播途徑主要還是通過鯽魚的體表黏液進行魚體之間進行橫向傳播、通過魚卵進行縱向傳播的可能性，這應(yīng)該是CyHV-2在池塘中傳播的主要途徑。需要注意的是，本試驗結(jié)果僅表明這2種傳播途徑的可能性，還需更為精確的試驗來證實其具體的傳播路徑。