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(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾161006)

0 引言

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是人畜共患腹瀉病的重要病原之一，能夠引起嬰幼兒感染甚至死亡，也能夠引起仔豬嚴(yán)重脫水性腹瀉。該病已經(jīng)嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。目前尚無治療該病的特效藥，疫苗接種是預(yù)防該病的最主要措施，但國內(nèi)外現(xiàn)有的幾種疫苗的免疫效果差強(qiáng)人意。因此，迫切需要發(fā)展有效的疫苗和抗病毒策略，這就需要進(jìn)行大量基礎(chǔ)研究，進(jìn)而對RV與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制進(jìn)行更深入理解，鑒于此，就RV的分子侵入機(jī)制進(jìn)行了研究進(jìn)展綜述，旨在為進(jìn)一步基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 病原學(xué)

RV為呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，為無囊膜的雙鏈RNA病毒，由3層同心蛋白包裹11個分節(jié)段雙鏈RNA，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)。VP4經(jīng)胰酶裂解為VP8*和VP5*蛋白。其中VP8*蛋白的抗原表位含有唾液酸結(jié)合區(qū)域，這一區(qū)域?qū)τ谛枰僖核徇M(jìn)行感染的RV來說是至關(guān)重要。VP5*含有一個能夠增加細(xì)胞膜通透性，從而提高病毒侵入細(xì)胞能力的區(qū)域，這與有囊膜病毒(如流感病毒)類似。VP5*包含了病毒融合功能區(qū)域，負(fù)責(zé)病毒侵入。VP4和VP7蛋白都與最初病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。它們通過順序性、特異性的與宿主細(xì)胞表面不同受體分子相互作用觸發(fā)細(xì)胞信號級聯(lián)放大而促進(jìn)RV侵入宿主細(xì)胞，在病毒侵入宿主細(xì)胞過程中擔(dān)當(dāng)重要角色[1]。

2 侵入機(jī)制

RV目前可能有兩種侵入途徑，一種是直接穿透細(xì)胞膜途徑，另一種是內(nèi)吞途徑。內(nèi)吞途徑又分為網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑、非網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白依賴的內(nèi)吞途徑和巨胞飲。病毒侵入宿主細(xì)胞作為病毒感染宿主的第一步，在病毒的整個生活周期中非常重要，同時也是研究者們制定抗病毒研究策略的重要靶標(biāo)和方向。

2.1 直接穿透細(xì)胞膜途徑

基于電鏡數(shù)據(jù)和觀察到的RV感染會誘導(dǎo)細(xì)胞膜的快速滲透，研究者提出直接的細(xì)胞膜穿透作為RV侵入宿主細(xì)胞的機(jī)制。通常RV經(jīng)腸道上皮細(xì)胞中的胰酶裂解被激活，從而提高其感染性。但有研究顯示，未經(jīng)胰酶激活RRV 株輪狀病毒同樣可以感染 MA104 細(xì)胞，所以推測其可能通過其他侵入途徑侵入宿主細(xì)胞。通過使用阻止內(nèi)體酸化的抑制劑(如 NH4Cl)或阻止內(nèi)吞泡的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)囊种苿┚荒芤种芌V感染；通過生化試驗(yàn)分析及電鏡觀察證明，RV的外層蛋白位于質(zhì)膜表面，而雙層衣殼的病毒粒子被內(nèi)化[2]。以上結(jié)果都支持了RV的直接侵入假說。

2.2 內(nèi)吞途徑

RV侵入宿主細(xì)胞是一個多步驟的需要多種受體分子協(xié)調(diào)的過程。人輪狀病毒如Wa、DS-1、WI69 株和動物輪狀病毒如UK、YM、TFR-41、SA11-4S、nar3株通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和內(nèi)體的酸化侵入宿主細(xì)胞，而猴輪狀病毒RRV株，通過不依賴于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白的內(nèi)吞途徑侵入宿主細(xì)胞。早期對RV感染細(xì)胞的電鏡研究顯示，內(nèi)吞作用為病毒內(nèi)化的途徑。更近些的研究發(fā)現(xiàn)，能破壞網(wǎng)格蛋白和小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞的相關(guān)藥物及顯性負(fù)突變體不會影響輪狀病毒感染宿主細(xì)胞，而細(xì)胞所表達(dá)的一種動力蛋白的顯性負(fù)突變體——即一種GTPase(在一些膜分離過程中有一定作用)不會被病毒所影響。這些結(jié)果加上所觀察到的膽固醇的消耗會抑制RV感染表明，為了進(jìn)入細(xì)胞，RV可能會用一種新確定的被描述為脂筏依賴的內(nèi)吞作用的細(xì)胞內(nèi)化途徑，這種內(nèi)吞途徑為非網(wǎng)格蛋白和小窩依賴的，它依賴于動力蛋白和其對膽固醇損耗的敏感性。最近還報道，洛霉素A，一種液泡質(zhì)子ATP酶泵的抑制劑，能夠阻斷RV感染?；谶@一發(fā)現(xiàn)，猜測可能存在一種內(nèi)吞機(jī)制與RV的侵入有關(guān)[3]。

2.2.1 網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑

受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是目前公認(rèn)的生物體攝取生物大分子的途徑，而網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑是最主要的受體介導(dǎo)途徑。對TFR-41，Wa，UK和RRV株RV的研究顯示，用高滲溶液處理細(xì)胞從而阻礙網(wǎng)格蛋白網(wǎng)的形成，并且使網(wǎng)格蛋白重鏈無法表達(dá)，會減少除RRV株RV的其他三種毒株的感染力，這表明這三種毒株是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑侵入細(xì)胞的。經(jīng)蔗糖或NH4Cl(可破壞細(xì)胞的網(wǎng)格蛋白)處理的Caco-2和MA104細(xì)胞中，UK株RV顆粒數(shù)量明顯減少，而RRV株RV顆粒數(shù)量無明顯變化，這表明UK株RV的侵入依賴于網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體的酸化，而RRV株RV的侵入不依賴于網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體的酸化[2-4]。

2.2.2 非網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白依賴性內(nèi)吞途徑

目前對RRV株RV侵入細(xì)胞機(jī)制研究較多，其是一種對經(jīng)神經(jīng)氨酸酶(NA)處理的細(xì)胞敏感的毒株，通過整合素α2β1、α5β3和熱休克蛋白hsc70作為受體，通過非網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白介導(dǎo)的依賴于功能性動力蛋白和細(xì)胞表面出現(xiàn)的膽固醇途徑侵入細(xì)胞。脂筏是一種在質(zhì)膜中形成橫向裝配的富含鞘糖脂和膽固醇的膜微結(jié)構(gòu)域，它被認(rèn)為能夠作為頂端細(xì)胞蛋白質(zhì)排列和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性平臺，而且同樣也富含磷脂酰肌醇(GPI)連接蛋白和其他的信號蛋白和受體，是細(xì)胞進(jìn)行多種生命活動的活躍區(qū)域，參與跨膜運(yùn)輸分選、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架重建等過程。一些有囊膜病毒和無囊膜病毒通過脂筏侵入宿主細(xì)胞的報道也在不斷增多。

研究發(fā)現(xiàn)，藥物和顯性負(fù)性變體影響網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞，但不影響RV感染細(xì)胞。膽固醇的下降也可以抑制RV的感染，結(jié)合這些結(jié)果表明，RV的侵入必須應(yīng)用新定義的內(nèi)化途徑——即脂筏依賴的內(nèi)吞。它不依賴于網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白，但依賴于膽固醇，并且對膽固醇的減少較敏感，細(xì)胞膜膽固醇的消耗會大大削弱RV的感染。如前文提到，RV吸附細(xì)胞似乎依賴于神經(jīng)節(jié)苷脂。有研究顯示，耐NA和NA敏感性RV的感染力都被神經(jīng)鞘糖脂生物合成抑制劑(PDMP)部分阻斷，而不被細(xì)胞O-鞘糖脂的抑制所影響。此外，從含β-甲基環(huán)化糊精的細(xì)胞膜中提出的膽固醇會將RV的感染力減少超過90%，而不會影響它們結(jié)合到細(xì)胞上。基于這些研究表明，脂筏可能與RV侵入細(xì)胞有關(guān)。更近些的報道顯示，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、整合素亞單位α2和β3及hsc70都與MA104細(xì)胞中的脂筏有關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)感染性病毒粒子與細(xì)胞感染早期的這些微結(jié)構(gòu)域有關(guān)[5]。總之，這些觀察結(jié)果表明，脂筏可能在RV的細(xì)胞侵入中起重要作用，其在此過程中充當(dāng)組織腳手架，從而促進(jìn)病毒粒子與細(xì)胞受體間的有效相互作用。

3 結(jié)語

RV侵入宿主細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程，涉及一些細(xì)胞表面受體和一些外層病毒蛋白的區(qū)域。至少有一些細(xì)胞受體與蛋白質(zhì)間的相互作用以順序的方式發(fā)生，它們似乎發(fā)生在鞘糖脂豐富的脂質(zhì)微區(qū)域。所需要的一些細(xì)胞分子可能解釋這些病毒的細(xì)胞和組織趨向性。盡管已鑒定出許多細(xì)胞分子與早期的病毒與細(xì)胞表面的相互作用有關(guān)，但仍需確定的是哪種受體在病毒侵入、病毒蛋白與這些受體的相互作用引起的構(gòu)象改變中和病毒內(nèi)化的機(jī)制中起作用。RV侵入宿主細(xì)胞機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及多種不同的侵入方式。不同毒株的RV侵入細(xì)胞以不同的途徑，同種毒株RV侵入不同細(xì)胞的途徑也可能不同，同種RV株的野生型與經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)多代的適應(yīng)型的侵入途徑也可能有所不同。確定RV自然感染成熟腸上皮細(xì)胞所用的受體和侵入途徑的工作尤為重要。

[1] 聞曉波，冉旭華，宋佰芬. 輪狀病毒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[2] Lopez S, Arias CF. Early steps in rotavirus cell entry.Springer-Verlag Berlin Heideberg[J]. CTMI，2006，309：39-66.

[3] Gutiérrez M, Isa P, Sánchez-San Martin C,etal.Different rotavirus strains enter MA104 cells through different endocytic pathways: the role of clathrin-mediated endocytosis[J]. J Virol，2010，84(18)：9161-9169.

[4] Sanchez-San Martin C, Lopez T, Arias CF, et al. Characterization of rotavirus cell entry[J]. Journal of virology，2004，78(5)： 2310-2318.

[5] Ewers H, Helenius A. Lipid-Mediated Endocytosis[J]. Cold Spring HarbPerspectBiol，2011 ，3(8)：a004721.