徐志偉，石林惠，李桃紅，董縐縐

作者單位： 315040寧波，寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種氣流受限不完全可逆且呈進(jìn)行性發(fā)展的肺部疾病。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，到2020年全球 COPD的死亡率將升至第3位。COPD的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如吸煙、職業(yè)性粉塵及化學(xué)物質(zhì)（蒸汽、刺激物、煙塵）等，其中吸煙是最常見(jiàn)也是最危險(xiǎn)的因素，90%的COPD患者都是吸煙者[1]。香煙接觸后即使離開(kāi)香煙煙霧環(huán)境，但氣道慢性炎癥仍進(jìn)行性發(fā)展，此過(guò)程推測(cè)可能與香煙煙霧誘導(dǎo) DNA損傷有關(guān)[2]。H2AX參與DNA雙鏈斷裂（DSB）的識(shí)別和修復(fù)。本研究擬通過(guò)細(xì)胞水平探討香煙煙霧提取物（CSE）誘導(dǎo)人氣道上皮（HBE）細(xì)胞的DNA損傷，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而揭示慢性氣道炎癥性疾病的可能發(fā)病機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 人正常氣道HBE（上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），香煙為專供研究所用的無(wú)任何添加劑的香煙（焦油量10mg，煙氣煙堿1mg），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司），DMSO（美國(guó)Sigma公司），IL-6放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。按Nakamura等[3]方法，將2支去過(guò)濾嘴香煙于一個(gè)注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸而燃著，吸入的煙霧經(jīng)三通另一個(gè)出口通入50 ml無(wú)血清培養(yǎng)液中制成懸液。懸液用1mol/LNaOH調(diào)至pH值為7.4，經(jīng)0.22 m微孔濾膜過(guò)濾備用。制備的CSE凍存于－40℃冰箱，解凍后在30 min之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及CSE干預(yù) 含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HBE細(xì)胞，細(xì)胞放置于37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，用胰蛋白消化傳代或計(jì)數(shù)后種板實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。接種細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，接種于6孔板中，在細(xì)胞融合率達(dá)到70%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，加入1.0%CSE、2.0%CSE、3.0%CSE、4.0%CSE分別干預(yù)HBE細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，4h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，結(jié)果最少重復(fù)3次。離心，存入－80℃冰箱，統(tǒng)一ELISA測(cè)量IL-6表達(dá)水平。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 用1.0%CSE、2.0%CSE、3.0%CSE干預(yù)HBE細(xì)胞4 h后，將生長(zhǎng)融合至85%左右的細(xì)胞消化，制成懸液，反復(fù)吹打成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以每皿200個(gè)細(xì)胞的梯度密度接種10 cm培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，隔天觀察細(xì)胞克隆形成情況，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS輕輕浸洗2次，4%多聚甲酸固定細(xì)胞15 min，去除固定液，滴加Wright-Giemsa覆蓋培養(yǎng)皿底部，室溫染色2min；滴加等量磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動(dòng)，使磷酸鹽緩沖液、Wright-Giemsa混勻，室溫靜置8 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥；將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，計(jì)數(shù)克隆數(shù)；克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4 ELISA檢測(cè)上清液細(xì)胞因子表達(dá)水平 對(duì)照組、1.0%CSE、2.0%CSE、4.0%CSE細(xì)胞培養(yǎng)上清液統(tǒng)一 ELISA測(cè)量IL-6表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞免疫熒光 經(jīng)1.0%CSE、2.0%CSE、4.0%CSE干預(yù)HBE細(xì)胞及對(duì)照組HBE細(xì)胞，用PBS洗滌后，4%多聚甲醛進(jìn)行固定。PBS洗滌后用0.3%Triton X 100室溫通透。再經(jīng)PBS洗滌，5%BSA室溫固定1 h。隨后用鼠抗人 H2AX單克隆抗體（1∶500稀釋)，4℃過(guò)夜。PBS洗滌3次，用Alexa Flour 488/594標(biāo)記的羊抗鼠(1∶1 000稀釋)于37℃溫育1 h。洗滌后，DAPI室溫染色 10 min，中性樹(shù)脂封片后可于熒光顯微鏡下拍照觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0及Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用ANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆形成實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)經(jīng)1.0%CSE干預(yù)后 HBE細(xì)胞的克隆形成率為（58.1±11.1）%，2.0%CSE的克隆形成率為（28.4±7.2）%，3.0%CSE的克隆形成率為（10.2±4.5）%，4.0%CSE的克隆形成率為（12.8±5.3）%，各組克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=255.3，P＜ 0.05）。

2.2 不同濃度CSE干預(yù)細(xì)胞后IL-6表達(dá)情況 對(duì)照組IL-6表達(dá)（9.26±5.38）pg/ml，1.0%CSE組IL-6 表達(dá)（8.26±3.90）pg/ml，2.0%CSE組IL-6 表達(dá)（20.82±5.83）pg/ml，4.0%CSE組IL-6 表達(dá)（57.70±14.39）pg/ml，各組IL-6表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.66，P＜0.05）；與對(duì)照組相比，干預(yù)組上清液IL-6的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），除1.0%CSE組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.216），2.0%CSE組、4.0%CSE組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012、0.006）。

2.3 不同干預(yù)方式下HBE細(xì)胞DNA損傷表達(dá)情況 通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量和大小可反應(yīng)細(xì)胞DNA損傷的情況。HBE細(xì)胞經(jīng)1.0%、2.0%、4.0%CSE干預(yù)4 h后，免疫熒光染色結(jié)果顯示，H2AX表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為（9.26±5.38）%、（20.82±5.83）%及（57.06±14.38）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.14，P＜0.05），提示HBE細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)隨CSE濃度增加而增加。封四彩圖3。

3 討論

吸煙是COPD主要發(fā)病危險(xiǎn)因素[4]，部分吸煙 COPD患者在戒煙后氣流受限仍進(jìn)行性發(fā)展，氣道中慢性炎癥持續(xù)存在，并對(duì)激素表現(xiàn)不敏感[5]。有學(xué)者推測(cè)是機(jī)體對(duì)香煙煙霧產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷，啟動(dòng)氣道慢性炎癥反應(yīng)[6]。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討香煙煙霧誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)。

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBE細(xì)胞經(jīng)CSE干預(yù)后細(xì)胞增殖能力明顯減弱，不同濃度CSE干預(yù)HBE細(xì)胞，上清提取液行Elisa檢測(cè)顯示炎性因子IL-6表達(dá)水平隨CSE濃度增高而增高，提示CSE對(duì)支氣管上皮細(xì)胞造成炎性損傷。IL-6不僅具有促炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，還具有炎癥放大作用，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。DNA雙鏈斷裂（DSBs）是由于多種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如活性氧、電離輻射及化學(xué)藥物等導(dǎo)致，機(jī)體對(duì)此具備一定的修復(fù)能力。發(fā)生DSBs時(shí)，組蛋白H2AX的C末端139位絲氨酸發(fā)生磷酸化，與斷裂位點(diǎn)呈相應(yīng)的數(shù)量關(guān)系，因此，H2AX是目前檢測(cè)DSBs的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。本研究通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CSE誘導(dǎo)HBE細(xì)胞 H2AX陽(yáng)性表達(dá)，且隨CSE干預(yù)濃度增高，HBE中 H2AX陽(yáng)性表達(dá)數(shù)也隨之增高。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可初步解釋吸煙導(dǎo)致氣道慢性炎癥持續(xù)存在的可能機(jī)制，即CSE可能通過(guò)IL-6擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA損傷，并影響HBE細(xì)胞基因組穩(wěn)定性及其增殖活力，進(jìn)而導(dǎo)致慢性氣道炎癥的持續(xù)進(jìn)展。