劉冠琳，程躍，謝國海，嚴澤軍，袁鶴勝

作者單位： 315010寧波，寧波大學附屬寧波市第一醫(yī)院，寧波市泌尿系疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究重點實驗室

哺乳動物的小腸黏膜上皮是機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，腸黏膜上皮終生進行著不間斷的自我更新，因為位于腸道隱窩部位的干細胞保持著旺盛的增殖分化能力。凋亡脫落及受損壞死的細胞與干細胞增殖、分化之間保持著動態(tài)平衡，由此可見腸道干細胞在維持腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能完整以及損傷后的修復中扮演著重要角色。因此，利用體外培養(yǎng)技術(shù)對腸干細胞進行原代培養(yǎng)，有助于進一步了解影響腸道干細胞增殖和分化的因素及機制，對臨床治療腸道損傷和某些代謝性疾?。ㄈ缑谀蛳到Y(jié)石）將有重要的意義[1-3]。血清的質(zhì)量和濃度對原代細胞的貼壁和生長有著相當大的影響，本實驗通過對常用血清和其濃度進行篩選，擬找到相對適合腸干細胞群分離培養(yǎng)的血清種類及最佳濃度。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 發(fā)情期昆明系小白鼠6只，雌性4只，雄性2只，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，2：1同籠交配，陰栓檢出日記為受孕第1天。

細胞培養(yǎng)基為用于細胞生長的液體培養(yǎng)基。具體配制方法為：DMEM培養(yǎng)液中加入新生牛血清或胎牛血清（均購自GIBYCO公司），血清的濃度分別為5%、10%、15%及20%。除此以外，8種培養(yǎng)基中還含有以下成分，表皮生長因子20ng/ml，胰島素2g/ml，谷氨酰胺2 mmol/ml，青霉素及鏈霉素各100 U/ml。酶消化液的配制：本實驗中腸干細胞的分離采用酶消化法，所用的酶消化液含有2種成分：透明質(zhì)酸酶（購自Sigma公司，工作液濃度為100 U/ml），Ⅺ型膠原酶（購自Sigma公司，工作液濃度為300U/ml）。

細胞清洗液的配制：細胞清洗液采用加入了5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2 實驗方法

1.2.1 腸干細胞群的分離和培養(yǎng) 取孕17d昆明系小白鼠，采用斷頸法處死，先打開腹腔取出胚胎置于無菌培養(yǎng)皿中。而后打開胎盤取出胚胎鼠腸組織，置于細胞清洗液中，去除腸系膜，經(jīng)反復清洗（3次）后剪碎腸組織。將剪碎的腸組織用酶消化液進行消化，20 min后采用離心法(1 000 r/min，5 min)終止消化；然后通過反復沉降（5次，1 min/次），去除絕大多數(shù)成纖維細胞和平滑肌細胞等雜質(zhì)細胞；最后，將通過離心（1 000 r/min，5 min）獲得的細胞分別用8種細胞培養(yǎng)基溶解，種植于同一24孔板中（購自Corning公司），放置在二氧化碳恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后進行第1次換液，以后每72小時換液1次。連續(xù)觀察、記錄細胞生長情況。封二彩圖1為經(jīng)分離后得到的腸絨毛細胞團懸浮液，圖中可見分離出的單個細胞及腸絨毛細胞團。

1.2.2 腸干細胞群的鑒定 將所得的原代細胞傳5代后（約25d），將細胞轉(zhuǎn)至事先裝有蓋玻片的24孔板中，行細胞爬片，每72小時換液1次。7 d后，固定細胞（固定液由丙酮和無水乙醇按1∶1配制）。將所得細胞爬片用角蛋白18亞型抗體及波形蛋白抗體（購自Sigma公司）行免疫組化染色，以鑒定細胞的組織來源。

2 結(jié)果

2.1 腸干細胞群的形態(tài)及生長方式 24～48h后，細胞開始貼壁生長。顯微鏡下可見，除采用10%新生牛血清組外，其他組細胞均含有大量呈梭狀的間質(zhì)細胞，上皮細胞所占比例不足5%（封二彩圖2）。而采用含10%的新生牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，則貼壁生長的細胞絕大部分為上皮細胞。上皮樣細胞呈集落狀生長，主要有三種集落。其中，由典型上皮構(gòu)成的集落約占30%（封二彩圖3），由扁平上皮細胞構(gòu)成的集落約占20%（封二彩圖4），2種細胞混合生長的集落約占50%。

血清濃度為10%時，腸干細胞群在第3、4代達到生長分化的頂峰；而后干細胞逐漸減少，成熟的腸上皮細胞逐漸增多，直至最終凋亡。經(jīng)1個多月的培養(yǎng)，傳至第7～8代，腸干細胞群開始凋亡。上皮細胞在傳代生長的過程中，細胞形態(tài)逐漸改變，有些細胞在形態(tài)上類似于成纖維細胞等間質(zhì)細胞，但角蛋白18亞型抗體染色為陽性。而其他組的細胞，可一直持續(xù)生長，但經(jīng)過傳代，上皮細胞仍會逐漸減少。

2.2 腸干細胞群的鑒定 將采用含 10%的新生牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的腸干細胞群傳至第5代后，將獲得的細胞行細胞爬片后用角蛋白18亞型抗體（購自Sigma公司）行免疫組化染色，結(jié)果為陽性（封二彩圖5），而用波形蛋白抗體染色，其結(jié)果為陰性。同時，由于培養(yǎng)出的細胞群能進行5次以上的傳代，說明所培養(yǎng)的細胞中含有大量的有功能的腸干細胞。而其他組的細胞做相同的處理后，用角蛋白18亞型抗體行免疫組化染色，結(jié)果為陰性，而用波形蛋白抗體染色，其結(jié)果為陽性。

3 討論

腸干細胞是位于小腸黏膜隱窩底部的未分化細胞，它以對稱分裂和不對稱分裂兩種方式來維持隱窩內(nèi)穩(wěn)定的干細胞數(shù)量,并通過短暫擴增細胞，增殖分化成5種不同表型的終末細胞，即潘氏細胞、杯狀細胞、內(nèi)分泌細胞、腸吸收細胞和M細胞[4-5]。腸干細胞群的構(gòu)建對進一步研究腸損傷和某些代謝性疾?。ㄈ缑谀蛳到Y(jié)石）有著重要的意義。原代細胞培養(yǎng)，最為困難的環(huán)節(jié)就是細胞的純化。以往國外文獻報道中，小鼠腸干細胞群的構(gòu)建，所得細胞群多為間質(zhì)細胞和上皮細胞混和生長。這樣培養(yǎng)出來的細胞群固然有利于研究腸黏膜上皮的生長分化機制，但卻給腸干細胞本身的研究以及基因治療方法的探索造成了不小的困難。就當前的技術(shù)條件而言，獲得絕對純的腸干細胞是不可能的。但即使獲得組織學上相對純化的腸干細胞群，對進一步的研究也十分有意義。

血清的質(zhì)量和濃度對原代細胞的貼壁和生長有著相當大的影響[6]，選擇合適的血清質(zhì)量和濃度有著十分重要的意義。國外相關(guān)文獻報道中，腸干細胞群的構(gòu)建一般采用的是10%的小牛血清[7]，如前所述，效果不甚理想。本研究通過對胎牛血清和新生牛血清的幾種常用血清濃度進行篩選，發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)基采用10%的新生牛血清時，貼壁細胞絕大部分為成集落狀生長的上皮細胞，與國外報道的細胞形態(tài)基本符合，但雜質(zhì)細胞卻很少見到。由此可見，采用含10%新生牛血清的細胞培養(yǎng)基進行腸干細胞群的構(gòu)建可以獲得較為純化的腸干細胞群。當然，具體機制還有待進一步研究。

目前，腸道干細胞生物學研究仍存在一個缺憾，即還沒有一種得到公認的、能用于分離和培養(yǎng)腸干細胞的特異性標志物。因此，本實驗只能通過細胞形態(tài)學、功能狀況以及免疫組化等3個方面綜合進行細胞鑒定。如前所述，本次實驗所培養(yǎng)出的細胞就形態(tài)學而言，已出現(xiàn)與國外文獻報道基本符合的3種細胞集落。就功能而言，細胞能存活1個月以上，且至少能傳7～8代，這說明細胞群中必然含有大量的干細胞。國外相關(guān)文獻報道，角蛋白18亞型在腸干細胞所在集落中特異性表達[7]。將傳代后的細胞進行細胞爬片，行免疫組化染色，角蛋白18亞型抗體染色為陽性，說明細胞的組織學來源沒有錯誤。由于間質(zhì)細胞波形蛋白染色多表現(xiàn)為陽性，所以本研究中對所有的細胞均進行波形蛋白染色，結(jié)果顯示，其他組細胞染色均為陽性，而采用10%的新生牛血清培養(yǎng)的細胞染色結(jié)果為陰性，這更進一步證明所獲得的細胞組織學來源的正確性。

綜上所述，腸干細胞群的構(gòu)建可以達到在組織學上的純化，這不僅僅是一種方法學上的改進，對于腸干細胞本身的研究以及基因治療方法的探索都有著重要的意義。