★ 史毅 陳文彬 張博文 鄭紅梅 柴華文 葉耀輝*（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004）

植物中所包含的豐富的次生代謝物，是天然藥物開發(fā)的寶庫(kù)，從植物中篩選藥用活性物質(zhì)已成為炙手可熱的研究方向。植物內(nèi)生菌具有種類多、分布廣、生物學(xué)功能多樣等諸多優(yōu)點(diǎn)，并在寄生于宿主植物的過(guò)程中，自主產(chǎn)生一系列具有殺蟲、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及免疫抑制等藥用作用的活性物質(zhì)。因此，從植物內(nèi)生菌中尋找并開發(fā)新的生物活性物質(zhì)已成為當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，借助于生物發(fā)酵相關(guān)工程技術(shù)具有發(fā)酵周期縮短、能耗減小、生產(chǎn)成本降低、菌體生長(zhǎng)加快、副產(chǎn)物減少、產(chǎn)物產(chǎn)率提高且發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，過(guò)程易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等諸多優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步地開發(fā)了植物內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的應(yīng)用前景。由于每種內(nèi)生菌具有各自不同的菌種的特性，因而需要提供不同的發(fā)酵條件才可以幫助其生成發(fā)酵產(chǎn)物。故而當(dāng)前研究者在研究?jī)?nèi)生菌的發(fā)酵工藝時(shí)，主要圍繞發(fā)酵工藝優(yōu)化展開，包括培養(yǎng)基的不同營(yíng)養(yǎng)成分（碳源、氮源、微量元素等）以及發(fā)酵條件（溫度、pH值、溶氧量等）。

1 內(nèi)生真菌發(fā)酵種類的研究

內(nèi)生真菌的發(fā)酵方法研究主要包括液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵，前者占用空間小、周期短、產(chǎn)物生成量大、可分離純菌絲體、成本低等；后者則設(shè)備簡(jiǎn)單、發(fā)酵條件易控制、培養(yǎng)物中各成分均可得到充分利用等。兩種發(fā)酵方法各自具有不同的優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)其發(fā)酵目的選擇性使用。液體發(fā)酵主要用于內(nèi)生真菌的活性產(chǎn)物或提取物的相關(guān)研究中，如曾茜等［1］借助于液體發(fā)酵的方式來(lái)對(duì)蒿屬植物中的內(nèi)生真菌Penicillium sp.具有抗癌活性的產(chǎn)物進(jìn)行了相關(guān)研究；都曉偉等［2］采用了內(nèi)生菌液體發(fā)酵的方式來(lái)提高穿山龍?zhí)崛∥镏惺硎氃碥赵暮?；而固體發(fā)酵則主要側(cè)重于研究培養(yǎng)基配方的優(yōu)化及產(chǎn)物的分離鑒定情況，如李信軍等［3］對(duì)兩株內(nèi)生真菌菌株的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化；張瑤［4］采用固態(tài)發(fā)酵的方式研究了白木香內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的分離鑒定情況。

目前隨著將中藥運(yùn)用于藥用或食用真菌的發(fā)酵基質(zhì)，一種新型的固體發(fā)酵方法也油然而生［5］。當(dāng)具有活性成分的藥性基質(zhì)被藥用真菌發(fā)酵時(shí)，不僅可以提供真菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其大量生長(zhǎng)，還能夠因?yàn)檎婢拿付淖兤湓械慕M織成分，因此該種發(fā)酵方式具有雙向性。如當(dāng)藥用人參在靈芝中發(fā)酵時(shí)，隨著一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)及生化反應(yīng)，將會(huì)產(chǎn)生新成分與新功能［6］。莊毅等［7］就借助了雙向性發(fā)酵工程發(fā)現(xiàn)了新藥槐芪菌質(zhì)。并發(fā)現(xiàn)槐耳菌和黃芪組合發(fā)酵后所生產(chǎn)的槐芪菌質(zhì)所提成分具有保肝、促進(jìn)機(jī)體免疫功能及抗病毒等藥理作用。

2 培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵的影響

內(nèi)生菌發(fā)酵的培養(yǎng)基主要被用于為內(nèi)生菌生長(zhǎng)或者代謝提供所需的能量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其成分的組成不僅會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)和繁殖能力及發(fā)酵物的生成效率造成直接性的影響，而且還會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量及質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響［8］。通常情況下，培養(yǎng)基的成分會(huì)根據(jù)菌體的品種、發(fā)酵條件的差異及發(fā)酵階段的不同而進(jìn)行選擇。在培養(yǎng)基中直接影響其質(zhì)量的四大營(yíng)養(yǎng)要素分別為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽以及生長(zhǎng)因子［9］。

2.1 培養(yǎng)基中碳源成分對(duì)發(fā)酵的影響培養(yǎng)基中的碳源成分是被用來(lái)為微生物提供能量、輔助細(xì)胞結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物的生成。碳源主要是由單糖、雙糖、多糖、油脂、天然復(fù)合物等成分所構(gòu)成，淀粉、葡萄糖、蔗糖等是最為常用的碳源。適宜的碳源種類和濃度將會(huì)直接對(duì)菌體生長(zhǎng)和芽孢生成造成影響［10］。李莎莎等［11］在對(duì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)研究中發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)有機(jī)碳源玉米漿的利用效果最好，培養(yǎng)24h后菌量可達(dá)到3.58×108CFU/mL。劉超等［12］在對(duì)菌種不同碳源的利用情況的研究中發(fā)現(xiàn)，菌株XP-8無(wú)法利用單糖中的蘋果酸；而對(duì)各個(gè)碳源的利用能力分別為麥芽糖＞葡萄糖＞木糖＞可溶性淀粉。白建軍等［13］研究發(fā)現(xiàn)，沙棘根瘤內(nèi)生菌對(duì)碳源要求比較嚴(yán)格，多數(shù)只能利用丙酸或葡萄糖、吐溫等。李倩瑋等［14］選用7種類型的培養(yǎng)基對(duì)花生種子中內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，結(jié)果表明，選擇牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細(xì)菌最多，有57株，而以乙烯（ACC）為唯一碳源的內(nèi)生細(xì)菌最少，為23株。

2.2 培養(yǎng)基中氮源成分對(duì)發(fā)酵的影響氮源是微生物蛋白質(zhì)和其他含氮有機(jī)物的來(lái)源。氮源主要分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，包括蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、硫酸銨、硝酸銨、等。由于銨鹽中的氮與細(xì)胞中的氮處于相同的氧化水平，故比較之下無(wú)機(jī)氮更容易被菌體快速吸收利用［15］，雖然有機(jī)氮延長(zhǎng)了菌體的吸收利用時(shí)間，但有機(jī)氮可以顯著地促進(jìn)菌體增殖和芽孢的生成。總體來(lái)說(shuō)，菌體酶系在生長(zhǎng)初期沒(méi)有構(gòu)建完整時(shí)，無(wú)機(jī)氮源會(huì)幫助菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用；然而在后期酶系完善構(gòu)建后，則菌體會(huì)分解并利用富含更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有機(jī)氮源。

除了碳源、氮源的構(gòu)成種類對(duì)菌體產(chǎn)生影響外，適宜的碳氮比也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的影響，不當(dāng)?shù)奶嫉葧?huì)使菌體按照一定的比例對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行吸收，將會(huì)抑制菌體的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成效率。因此有效地調(diào)控培養(yǎng)基成分中的碳氮比，可以幫助菌體的生長(zhǎng)，提升產(chǎn)物的生成效率。Idris等［16］研究發(fā)現(xiàn)，以ACC為唯一氮源的內(nèi)生菌的比例（36%）較根際微生物的比例（20%）高。郭偉等［17］研究發(fā)現(xiàn)不同氮源培養(yǎng)基中，蛋白胨作為氮源時(shí)菌落生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)20d后菌絲體增至6.47mm。王曉洋等［18］在不同氮源對(duì)菌株溶磷效果比較實(shí)驗(yàn)研究中，得出四株內(nèi)生細(xì)菌在以以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中溶磷效果最佳，W3溶磷能力最強(qiáng)，且改變無(wú)機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳氮比對(duì)菌株W3的溶磷效果有影響。

2.3 培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)發(fā)酵的影響培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽成分會(huì)直接影響微生物的正常生長(zhǎng)及產(chǎn)物的生成。研究表明，當(dāng)金屬離子的濃度過(guò)低時(shí)，會(huì)促進(jìn)菌體的生理活動(dòng)，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)則會(huì)阻礙微生物的正常代謝及繁殖。比如無(wú)機(jī)鹽中的磷元素，參與了微生物的生理代謝活動(dòng)并構(gòu)成了細(xì)胞中核酸等輔酶的生成。江明明等［19］把所得的內(nèi)生菌菌懸液接種于NBRIP無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d，通過(guò)有無(wú)解磷圈的生成及生成解磷圈的大小來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)生菌的解磷能力。無(wú)機(jī)鹽中的鈣離子不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理狀態(tài)，而且可以提高發(fā)酵的含菌量，促進(jìn)菌體發(fā)酵時(shí)的效率。除上述提及到的無(wú)機(jī)鹽外，鋅、鎂、鈷、鉬、錳以及鐵等元素都是微生物賴以生長(zhǎng)的微量元素，均在一定程度中影響發(fā)酵產(chǎn)物的生長(zhǎng)情況。林星辰等［20］在優(yōu)化人參內(nèi)生菌B69抑菌活性產(chǎn)物的發(fā)酵條件中，從11種不同的無(wú)機(jī)鹽組合中篩選了最適合其生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)鹽條件為0.5%的NaCl。宋歌等［21］在將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加污染物作為唯一碳源篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株CPY-4和菌株SGL-1可以在只提供4-BDE的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中存活，菌株CPY-4，SGL-1、菌株4、菌株13可以在提供BDE209和aroclor1254的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中存活。

3 培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵的影響

除了培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵具有重要的影響外，發(fā)酵條件在對(duì)于菌體的生長(zhǎng)中也發(fā)揮了重要作用，適宜的培養(yǎng)條件，不僅有助于菌體的生長(zhǎng)繁殖，而且可以提高微生物對(duì)底物的利用能力，使代謝朝向有益于發(fā)酵產(chǎn)物的生成進(jìn)行。因而通過(guò)調(diào)控發(fā)酵條件（溶氧量、溫度、pH值等），能夠?yàn)榫w的生長(zhǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境，從而提升微生物的繁殖能力、獲得質(zhì)量更高的發(fā)酵產(chǎn)物。

3.1 溫度對(duì)發(fā)酵的影響溫度作為影響內(nèi)生菌代謝生長(zhǎng)過(guò)程中至關(guān)重要的影響因素，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中將會(huì)對(duì)內(nèi)生菌細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性、物質(zhì)的溶解及酶活性產(chǎn)生重要的影響。當(dāng)培養(yǎng)的溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)一定程度內(nèi)破壞適合菌體生長(zhǎng)的平衡環(huán)境，進(jìn)而阻礙菌體的正常生長(zhǎng)，此外溫度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致菌體中的蛋白質(zhì)成分發(fā)生凝固及變性，甚至造成菌體死亡；當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，也會(huì)嚴(yán)重影響菌體的正常生長(zhǎng)，因此在發(fā)酵培養(yǎng)菌體的過(guò)程中需要為菌體的生長(zhǎng)創(chuàng)造合適的溫度環(huán)境［22］。

溫度除了受菌體種類的影響外，還會(huì)由于產(chǎn)物的不同而所需的溫度不同。在優(yōu)化發(fā)酵溫度的階段中還需要綜合參考其他的發(fā)酵條件及因素，例如能源消耗、發(fā)酵周期、產(chǎn)率水平和培養(yǎng)基成分等，必要時(shí)還可以考慮變溫培養(yǎng)。王壯等［23］在篩選五味子葉枯病菌拮抗放線菌A-25-8的發(fā)酵溫度條件時(shí)，選擇了溫度為25℃、28℃、31℃和34℃等4個(gè)梯度，最終得出28℃為該菌的溫度最佳條件。李艷賓等［24］以產(chǎn)黃酮甘草內(nèi)生真菌YF-A為研究對(duì)象，在研究發(fā)酵溫度對(duì)其發(fā)酵影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)該內(nèi)生真菌的最佳發(fā)酵溫度為32℃。李娟等［25］發(fā)現(xiàn)菌株X對(duì)病原菌的抑制率隨溫度的變化基本上呈倒鐘型，從24℃到28℃，隨著溫度的升高，其體內(nèi)生化反應(yīng)速率上升，其抑制率也逐漸上升，由28.34%升高到46.57%。

3.2 pH值對(duì)發(fā)酵的影響pH值是確保菌體正常繁殖、代謝的重要參數(shù)，選擇合適的pH值將會(huì)對(duì)不同種類的菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的合成造成重要的影響。其主要原因在于：（1）pH值可以通過(guò)影響菌體內(nèi)各種酶的活性，來(lái)進(jìn)一步地對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝造成影響；（2）pH值能夠通過(guò)影響培養(yǎng)基中某些重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率及中間代謝產(chǎn)物的解離來(lái)間接地影響內(nèi)生菌對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用［26］；（3）pH值可以改變?cè)|(zhì)膜的電荷，從而使細(xì)胞膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性均受到了一定的影響，最終影響了菌體對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制了菌體的生長(zhǎng)速率［27］；張濤等［28］人在探究煙草黑脛病拮抗菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在pH3～6（酸性條件）時(shí)抑制效果較差，7～9（中性或弱堿條件）時(shí)抑制效果較好，其中以pH7.6（自然）對(duì)煙草黑脛病的抑制作用最好。李欣等［29］研究拐棗七的莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌GZJR-8時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌發(fā)酵最適pH為7.5～8。

3.3 溶氧對(duì)發(fā)酵的影響在好氧真菌的發(fā)酵過(guò)程中，通常會(huì)通過(guò)控制溶氧量來(lái)達(dá)到調(diào)控發(fā)酵的目的。溶氧不僅能夠?yàn)榫w的正常生長(zhǎng)及代謝提供所需的氧氣，而且它還會(huì)對(duì)菌體次生代謝產(chǎn)物的合成途徑及合成速率造成嚴(yán)重的影響。若供氧不足，則會(huì)造成內(nèi)生菌無(wú)法正常的吸收代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，甚至?xí)绊懓l(fā)酵液中的酸堿度，進(jìn)而促進(jìn)了有毒物質(zhì)的生成，此外，供氧不足還會(huì)抑制發(fā)酵產(chǎn)物形成前的前體物質(zhì)的積累，從而阻礙了菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的合成。菌體發(fā)酵過(guò)程中的供氧一般是通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量、攪拌速度、轉(zhuǎn)速、裝液量等來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

周寧等［30］在對(duì)甘蔗葉產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的溶氧量。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速由100r/min升至125r/min時(shí)菌絲體生物量明顯增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到125r/min時(shí)有最大生物量積累，超過(guò)125r/min時(shí)生物量緩慢下降。當(dāng)轉(zhuǎn)速緩慢時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧也會(huì)隨之減少，這不僅會(huì)影響菌絲的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致代謝產(chǎn)物產(chǎn)量降低；當(dāng)轉(zhuǎn)速增加時(shí)，培養(yǎng)基發(fā)酵液中的溶氧量也顯著增加，但倘若轉(zhuǎn)速過(guò)快時(shí)，由于強(qiáng)烈的機(jī)械刺激，會(huì)促使細(xì)菌發(fā)生機(jī)械性的損傷，會(huì)嚴(yán)重抑制菌絲和產(chǎn)物的產(chǎn)量。葉云峰等［31］人研究發(fā)現(xiàn)在眾多影響枯草芽抱桿菌B47產(chǎn)抗菌物質(zhì)的因素中裝液量的影響力是最強(qiáng)的，隨著裝液量的減少菌體生成產(chǎn)物的能力逐漸增強(qiáng)，由此可見(jiàn)裝液量（溶氧）對(duì)菌體產(chǎn)物的生成是成正相關(guān)的。一般情況下，發(fā)酵培養(yǎng)液中裝液量越少，溶氧量就越大。較少的裝液量有益于提高溶氧，但是太少也會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而阻礙菌體的正常生長(zhǎng)；較多的裝液量能夠?yàn)榫w的繁殖供應(yīng)足夠的營(yíng)養(yǎng)，但另一方面會(huì)導(dǎo)致溶氧能力下降，不足以維持菌體增殖所需要的氧分［32］。

雖然目前在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多的研究者研究了溶氧條件的優(yōu)化，但關(guān)于內(nèi)生菌發(fā)酵系統(tǒng)中氧傳遞的相關(guān)研究甚少，尤其是對(duì)如何在使用生物反應(yīng)器來(lái)進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵時(shí)借助通氣和攪拌來(lái)增加發(fā)酵液中的溶氧還鮮見(jiàn)研究，因此未來(lái)關(guān)于對(duì)氧傳遞方面的研究將會(huì)為后續(xù)指導(dǎo)反應(yīng)器放大工作產(chǎn)生重要的影響。

3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵過(guò)程中選擇合適的培養(yǎng)時(shí)間不僅節(jié)省了整個(gè)發(fā)酵工藝時(shí)間，而且還降低了發(fā)酵成本。柏鈺等［33］選用了8個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)來(lái)測(cè)定發(fā)酵罐和搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液的抗菌作用，結(jié)果顯示當(dāng)罐發(fā)酵3d時(shí)每100mL發(fā)酵液中菌體生物量達(dá)到最高（1.65±0.052）g，4d時(shí)抗菌活性最高為（33.56±1.34）%；而搖瓶發(fā)酵在5d時(shí)每100mL發(fā)酵液中菌體生物量達(dá)到最高（0.82±0.035）g，7d時(shí)抗菌活性最高為（53.20±0.76）%。由此找出了最適宜的發(fā)酵條件，為發(fā)酵優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化通常都是通過(guò)設(shè)定不同發(fā)酵時(shí)間梯度來(lái)確定最適宜發(fā)酵時(shí)間的，如史云峰等［34］在研究?jī)?yōu)化皺邊石杉高產(chǎn)HupA功能內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基最佳時(shí)間時(shí)，分別在4個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置了兩個(gè)平行樣，恒溫振蕩培養(yǎng)測(cè)定HupA的產(chǎn)量。

在調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)條件時(shí)，除了能夠?qū)囟取H、溶氧、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行改變外，還可以通過(guò)改變接種齡來(lái)實(shí)現(xiàn)。接種齡是指從菌絲接種于種子罐到將其轉(zhuǎn)移到下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐間的時(shí)間。若接種時(shí)種齡偏小，則會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)變緩、發(fā)酵周期被延長(zhǎng)、發(fā)酵產(chǎn)物生成時(shí)間被拖延，甚至?xí)甬惓０l(fā)酵的情況發(fā)生。若接種時(shí)種齡偏大，亦會(huì)加快菌體消耗培養(yǎng)基的速度，誘發(fā)菌體快速生長(zhǎng)，進(jìn)而使得菌體過(guò)早自溶，因此，選擇適當(dāng)?shù)姆N齡是非常重要的［35］。

4 優(yōu)化內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的方法

在研究?jī)?nèi)生菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化問(wèn)題時(shí)，通常會(huì)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法來(lái)調(diào)控各個(gè)影響內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的因素，使發(fā)酵效率得以提升，最終系統(tǒng)、高效、低成本的獲得內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物。就目前來(lái)看，在優(yōu)化發(fā)酵工藝時(shí)普遍應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，但隨著統(tǒng)計(jì)方法的發(fā)展，出現(xiàn)了Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案篩選并結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，兩者共同應(yīng)用優(yōu)化發(fā)酵工藝。

4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是采用正交表對(duì)多因素進(jìn)行分析的一種數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中設(shè)定多個(gè)因素和變量，通過(guò)對(duì)比分析找出符合實(shí)驗(yàn)條件的最佳他因素組合。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法可以很好地判斷影響微生物發(fā)酵的主要因素。該法具有方法簡(jiǎn)單、效率高以及工作量小等特點(diǎn)，進(jìn)而廣泛應(yīng)用于內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化。馬冠華等［36］通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行4因素正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行16個(gè)因素組合實(shí)驗(yàn)，確定了煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57的最佳發(fā)酵條件：初始pH值7，培養(yǎng)時(shí)間72h，恒溫28℃，搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量25mL/500mL每瓶。

4.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法響應(yīng)面設(shè)計(jì)法（Response Surface Methodology，RSM）是將試驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析、數(shù)學(xué)建模等方法結(jié)合來(lái)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并利用多元二次回歸方程在因素和響應(yīng)值之間建立函數(shù)關(guān)系的擬合，從而優(yōu)化工藝參數(shù)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)法是解決多變量因素的最為簡(jiǎn)單有效的試驗(yàn)方法其中最為常用的方法是Box-Behnken設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）和中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）［37］。目前研究中，響應(yīng)面設(shè)計(jì)法通常會(huì)結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)來(lái)篩選影響發(fā)酵結(jié)果的重要因素，實(shí)現(xiàn)高效提升發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。孫力軍等［38］在研究金銀花內(nèi)生菌EJH-1時(shí)，采取了Plackett-Burman和響應(yīng)面等設(shè)計(jì)法優(yōu)化了金銀花內(nèi)生菌EJH-1產(chǎn)生抗菌作用的培養(yǎng)基。何璐等［39］利用Plackett-Burman分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選擇影響的主效應(yīng)因子，用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理、對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，最后利用RSM分析法，得到了苦參內(nèi)生真菌BS001菌株的最佳發(fā)酵條件。

5 內(nèi)生菌發(fā)酵工藝目前的缺點(diǎn)及今后的研究進(jìn)展

科學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)水平的快速發(fā)展使得內(nèi)生真菌發(fā)酵技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品業(yè)中得到了普及應(yīng)用，相信在未來(lái)能夠利用內(nèi)生菌發(fā)酵技術(shù)來(lái)解決更多的生產(chǎn)難題。不斷運(yùn)用內(nèi)生真菌發(fā)酵技術(shù)，探索、優(yōu)化、改進(jìn)發(fā)酵工藝能夠大幅的提升工作效率，并促使發(fā)酵工程技術(shù)往更為廣泛的領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)用價(jià)值［40］。近年來(lái)，內(nèi)生真菌的發(fā)酵生產(chǎn)越來(lái)越顯示出了巨大的發(fā)展前景，而且發(fā)酵工藝也到了有效的改進(jìn)，基于高產(chǎn)菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化等方法的改善使得內(nèi)生真菌產(chǎn)活性物質(zhì)的能力獲得了顛覆性的提高。然而，目前的研究項(xiàng)目大都停留在實(shí)驗(yàn)室階段，很難使大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)在中、大型企業(yè)中的到工業(yè)化的發(fā)展［41］。探其因由在于缺乏適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株，

以及發(fā)酵策略未能系統(tǒng)的調(diào)控。因此，尋找高產(chǎn)內(nèi)生菌株和建立系統(tǒng)性的內(nèi)生真菌發(fā)酵工藝控制流程，將成為今后最重要的研究方向。