劉定坤, 楊 楠，金巨樓，孫夢潔，王 倩，吳 佳，劉志輝

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春130021)

自2003年施松濤教授提取并分離出牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)之后，其作為一種可再生性間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生研究領(lǐng)域引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。臨床上，DPSCs易從阻生齒、多生牙以及正畸牙中的牙髓組織中提取。DPSCs在體外環(huán)境中易于培養(yǎng)，其傳代增殖后依然保存著良好的干細(xì)胞特性。對于輕、中度的牙齒損傷，DPSCs可遷移至損傷處，分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞參與反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成。目前，國內(nèi)成功開展了國際上首個全長牙髓再生的臨床研究，進(jìn)一步證明了DPSCs可作為種子細(xì)胞用于組織工程的可行性。本文對DPSCs的增殖、遷移以及分化的研究進(jìn)展做一綜述，以期為DPSCs在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)及臨床應(yīng)用方面的研究提供新的思路和策略。

1 DPSCs的生物學(xué)特征

牙髓是牙體組織的一部分，含有結(jié)締組織、間充質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)纖維、血管和淋巴等。Gronthos 等[1]收集了19～29 歲患者的第三磨牙，取出牙髓組織，用酶消化法得到單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞可以自我增殖，其免疫表型與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowstromal stem cells，BMSCs) 相似，在體外一定條件下可形成礦化結(jié)節(jié)；將細(xì)胞植于免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，有牙本質(zhì)樣組織形成，證明其可分化為類成牙本質(zhì)細(xì)胞。且該細(xì)胞又具有高度增殖和克隆能力，因此將其命名為DPSCs，證實了牙髓組織中干細(xì)胞的存在。

2DPSCs的增殖

隨著近些年科學(xué)技術(shù)的提高，諸多學(xué)者不斷嘗試新的培養(yǎng)方式，如改變物理環(huán)境、化學(xué)藥物刺激和支架共培養(yǎng)等，用于研究DPSCs的增殖以及如何加快DPSCs的增殖速度。

2.1 物理效應(yīng) 在三維動態(tài)模擬微重力、3D多孔培養(yǎng)、靜磁場和缺氧環(huán)境下培養(yǎng)等各種區(qū)別于正常的培養(yǎng)環(huán)境下，DPSCs的增殖速度均高于對照組。①三維動態(tài)模擬微重力。Li 等[2]探討三維動態(tài)模擬微重力環(huán)境中，人牙骨髓干細(xì)胞(hDPSCs)在裸鼠體內(nèi)乳酸-乙醇酸[poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]支架下的增殖及成牙本質(zhì)分化的能力，組織學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：實驗組中Ki-67、Ⅰ型膠原、牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白Ⅰ(dentin matrix protein-Ⅰ，DMPⅠ)表達(dá)均高于對照三維靜態(tài)培養(yǎng)組，表明在體內(nèi)三維動態(tài)模擬微重力環(huán)境條件下培養(yǎng)，可提高h(yuǎn)DPSCs的增殖及成牙本質(zhì)分化能力。②3D多孔培養(yǎng)。Bhuptani 等[3]發(fā)現(xiàn)：多孔微支架可以為干細(xì)胞的生長創(chuàng)造一個3D微環(huán)境，在體內(nèi)或體外控制其生長。該實驗使用互相關(guān)聯(lián)的多孔PLGA微支架促使DPSCs在體外增殖，觀測其生態(tài)學(xué)特征以及黏附性，并通過MTT和RT-PCR法檢測其增殖能力，結(jié)果表明：實驗組hDPSCs在平均增長數(shù)高于2D對照條件培養(yǎng)；此外，細(xì)胞活性和基因表達(dá)結(jié)果證實：實驗組hDPSCs的可塑性高于對照組hDPSCs可塑性，提示新型多孔微小支架作為三維培養(yǎng)基使組織干細(xì)胞工程更有前途。③靜磁場：Lew 等[4]通過在0.4 t靜磁場下hDPSCs和對照組分別培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：0.4 t磁場影響細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的活性，該效應(yīng)可以激活p38絲裂原活化蛋白酶信號通路，從而重組細(xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞增殖。④缺氧環(huán)境：Kanafi 等[5]發(fā)現(xiàn)：來源于脫落乳牙中的DPSCs相較于恒牙中的DPSCs在低氧環(huán)境中表現(xiàn)出更強的增殖能力。

2.2 化學(xué)藥物刺激及支架共培養(yǎng) 在培養(yǎng)環(huán)境中添加不同種類的物質(zhì)如胰島素樣生長因子1(insulin like growth factorⅠ，IGF-1)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[6]和黃瓜籽正丁醇提取物[7]等，hDPSCs可表現(xiàn)出高于對照組的增殖速度，與支架材料的共培養(yǎng)也可以顯示出實驗組的增殖速度明顯高于對照組。①生物膜。Soares 等[8]將膠原凝膠與殼聚糖溶液(2∶1)混合，再加入活性鋁酸鈣水泥形成礦物相的生物膜作為實驗組，惰性材料聚苯乙烯作為對照組，將hDPSCs接種于2種材料的表面，結(jié)果顯示：實驗組hDPSCs的增殖速度明顯高于對照組。②不同支架材料。Khojasteh 等[9]通過評估市場上提供的4種支架材料[SureOss、Cerabone、聚L-乳酸(PLLA)和OSTEON]對hDPSCs的黏附性、增殖及分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除SureOss外，所有生物支架材料均促進(jìn)hDPSCs黏附、增殖和分化，接種于聚PLLA支架上的細(xì)胞表現(xiàn)出的增殖和黏附性最高。

2.3 其他 DPSCs的增殖與機體生長階段也有關(guān)。Ling 等[10]通過觀察未成熟比格犬前磨牙不同程度的不可逆牙髓炎，早期DPSCs的增殖及成骨分化潛能強于后期。不同生長因子對DPSCs的增殖、分化和遷移等有著不同的作用。Wen 等[11]通過體外實驗比較基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 (stromal cell-derived factor-1，SDF-1)與粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)對hDPSCs增殖、遷移及分化的影響，結(jié)果顯示：與G-CSF比較，SDF-1對hDPSCs的增殖無明顯影響，但能明顯促進(jìn)hDPSCs遷移和分化能力。

3 DPSCs的遷移

趨化現(xiàn)象是一種復(fù)雜的生物行為，由趨化因子與受體結(jié)合而啟動，同時伴隨著細(xì)胞骨架的重排。趨化因子是一組能夠誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的分泌蛋白。

在齲病的最后階段，炎癥將會出現(xiàn)在齲齒下的髓室并誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡，hDPSCs可在一定程度上補救這一過程[12]。hDPSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，表達(dá)一系列趨化因子和附著受體。hDPSCs被表達(dá)在細(xì)胞外基質(zhì)的趨化因子所刺激，此后遷移至受損區(qū)域，在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和修復(fù)性牙質(zhì)形成中起重要作用。

Li 等[12]發(fā)現(xiàn)：SDF-1與其G耦合蛋白受體CXCR4相互作用來誘導(dǎo)SDF-1/CXCR4信號；hDPSCs的遷移被SDF-1以濃度依賴方式所誘導(dǎo)，也可以被CXC趨化因子受體4 小干擾RNA(siCXCR4)、細(xì)胞分裂周期42小干擾RNA(siCDC42)和藥物抑制劑[如CXCR4拮抗劑(AMD3100)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(LY294002)以及黏著斑激酶(FAK)抑制劑(PF573228)]所抑制；限制SDF-1的活性或阻止其與CXCR4的結(jié)合可降低hDPSCs的遷移能力；Western blotting檢測結(jié)果表明：SDF-1以劑量依賴方式影響CXCR的表達(dá)；Transwell實驗證明：在下室培養(yǎng)液中隨著SDF-1劑量增加，可見大量hDPSCs遷移至下室。SDF-1/CXCR4軸與FAK、PI3K、GSK3β和β-catenin通路相互作用一同調(diào)控hDPSCs遷移。

Wen 等[11]也發(fā)現(xiàn)：SDF-1對hDPSCs的增殖無明顯影響，但對遷移及成牙本質(zhì)分化的影響較G-CSF明顯。Yang 等[13]通過體外研究表明：SDF-1可以明顯提高h(yuǎn)DPSCs的遷移，自噬抑制劑明顯抑制hDPSCs的遷移，而自噬激活劑大大增強SDF-1α刺激細(xì)胞遷移的能力。Zeng 等[14]模擬臨床發(fā)現(xiàn)：根管沖洗后釋放出大量轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)并非bFGF，TGF-β1釋放到根管內(nèi)能夠誘導(dǎo)hDPSCs的遷移。

4DPSCs的分化

hDPSCs是牙髓未分化的外胚間充質(zhì)細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)劑作用下，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞等多種細(xì)胞[15-16]。Laino 等[17]從34例17～39歲的患者中取出第三磨牙，分離牙髓組織后成功誘導(dǎo)hDPSCs向成骨細(xì)胞分化。Almushayt 等[18]發(fā)現(xiàn):hDPSCs可以向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。Zhang 等[19]利用酶消化法分離人第三磨牙內(nèi)牙髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過其生物學(xué)行為證實其符合hDPSCs特征，且至少能維持其生物學(xué)特性在25代左右；分別用神經(jīng)性、骨性、脂肪性、成纖維性和軟骨性誘導(dǎo)介質(zhì)誘導(dǎo)可定向分化，具有5個方向的分化潛能。

4.1 炎癥和年齡對hDPSCs分化的影響 目前臨床上對于局限性及可逆性牙髓病變多選擇以保存活髓為目的的治療方法，但對行牙髓切斷術(shù)后切除的炎癥牙髓組織沒有采取合理的利用。Li 等[20]通過移植自體來源發(fā)炎牙髓組織中的干細(xì)胞修復(fù)人牙齒周圍的骨缺損，實驗結(jié)果顯示：實驗組炎癥組織來源的牙髓干細(xì)胞(DPSCs derived from inflammatory dental pulp tissue，DPSCs-IP)依然保持著成骨、成軟骨和成脂肪分化的潛能，相較于非炎癥組織來源的牙髓干細(xì)胞(DPSCs derived from normal dental pulp tissue，DPSCs-NP)，成骨分化潛能雖然有輕微的下降，但實驗組成軟骨和成脂肪分化能力無明顯變化。盡管DPSCs-IP成骨能力有輕微的降低，但是在臨床治療中，DPSCs-IP仍然是DPSCs-NP良好的替代品。Hozhabri 等[21]也發(fā)現(xiàn)：hDPSCs暴露于炎癥介質(zhì)時，NF-κB的低表達(dá)可以增強其向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的能力以及膠原蛋白的表達(dá)。為探討不同年齡段人體內(nèi)hDPSCs自身分化能力是否相同，Yi 等[22]通過檢測青年到老年不同年齡段捐獻(xiàn)者h(yuǎn)DPSCs的分化潛能發(fā)現(xiàn)：來自青年捐獻(xiàn)者的hDPSCs有著更強的增殖能力以及成骨分化和成脂肪分化能力。hDPSCs的活性受機體自身牙體狀態(tài)的影響，有炎癥的牙髓組織依然具有一定的利用價值。

4.2 成骨/成牙本質(zhì)分化能力 hDPSCs在機體內(nèi)對修復(fù)受損的牙本質(zhì)起著重要的作用，因此hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化一直是研究的熱點。此外，成牙本質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞有著相似的生理作用，因此對于hDPSCs向成骨細(xì)胞分化用以治療骨缺損也逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。按照不同的誘導(dǎo)分化方式，大致可分為物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)和生物誘導(dǎo)等。(1)物理誘導(dǎo)：①低氧環(huán)境。Wu 等[23]觀察經(jīng)過低氧預(yù)處理的hDPSCs向成骨細(xì)胞分化的能力發(fā)現(xiàn)：實驗組產(chǎn)生更多的礦化結(jié)節(jié)；檢測成骨基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)：實驗組hDPSCs mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組。說明低氧預(yù)處理的hDPSCs能夠明顯增強hDPSCs成骨方向的分化。Werle 等[5]研究表明：在低氧環(huán)境下hDPSCs的分化潛能與旁分泌作用增強有關(guān)。②氧化石墨烯(graphene oxide，GO)培養(yǎng)基。Rosa 等[24]用GO作為培養(yǎng)基檢測hDPSCs的生物相容性、分化潛能和物理及表面特性，實驗組培養(yǎng)基支持hDPSCs的黏附和增殖，能夠促進(jìn)其表達(dá)某些礦物質(zhì)基因(MSX-1、PAX-9、RUNX2、COL1、DMP-1以及DSPP)并且表現(xiàn)出良好的生物相容性。該實驗表明：在不使用化學(xué)誘導(dǎo)劑的情況下，GO可以誘導(dǎo)牙源性基因的高表達(dá)，未來可以著眼于特定種系的研究。③正畸負(fù)荷治療。Yu 等[25]對大鼠進(jìn)行正畸治療誘導(dǎo)牙齒重建發(fā)現(xiàn)：正畸治療在體內(nèi)通過活化促炎因子白細(xì)胞介素14-A(Interleukin-14A，IL-14A)改變牙髓微環(huán)境，明顯地促進(jìn)hDPSCs自我更新以及分化的能力；體外模擬體內(nèi)的白細(xì)胞介素17-A(Interleukin-17A，IL-17A)環(huán)境，實驗結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果一致；通過油紅O染色、茜素紅染色以及Western blotting分析：實驗組hDPSCs成脂、成骨能力均高于對照組。該研究結(jié)果表明：正畸治療促進(jìn)hDPSCs 自我復(fù)制以及增強多向分化的能力，尤其是在大鼠正畸負(fù)荷7 d后結(jié)果明顯。(2)化學(xué)誘導(dǎo)：①辛伐他汀。Jia 等[26]研究辛伐他汀在DPSCs增殖、分化方面的作用以及在活髓切斷術(shù)后DPSCs誘導(dǎo)髓室再生的作用，結(jié)果顯示：1 μmol·L-1辛伐他汀抑制犬DPSCs增殖，增加堿性磷酸酶的活性和礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，表明辛伐他汀具有促進(jìn)犬DPSCs成骨/成牙本質(zhì)分化的能力。②生物膜。Soares 等[8]將膠原凝膠與殼聚糖溶液(2∶1)混合，加入活性鋁酸鈣水泥為礦物相的生物膜構(gòu)成實驗組，惰性材料聚苯乙烯構(gòu)成對照組，將DPSCs接種于2組生物膜表面，檢測ALP、總蛋白、DMP-1/DSPP基因表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的沉積，結(jié)果顯示：生物膜誘導(dǎo)DPSCs分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞為高度分泌型。③支架材料。Khojasteh 等[9]評估市場上提供的4種支架材料(SureOss、Cerabone、PLLA 和 OSTEON )對hDPSCs的黏附性、增殖及分化的影響，結(jié)果顯示：培養(yǎng)14 d后，PLLA和OSTEON支架中的DPSCs與Cerabone支架比較ALP活性明顯升高，3種支架中培養(yǎng)的DPSCs成骨活性比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。④胰島素。Lauritano 等[27]證實胰島素可以影響DPSCs的增殖以及向成骨方向的分化，并將進(jìn)一步探索使用這種新方法進(jìn)行骨組織重建的研究。(3)生物誘導(dǎo)：糖代謝，特別是線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解，在細(xì)胞生命活動中起著重要的作用。糖代謝可以被重新編程來維持干細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)組織修復(fù)和再生。Wang 等[28]通過實驗發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞在誘導(dǎo)礦化的培養(yǎng)基上開始分化時，線粒體嵴變得細(xì)長發(fā)達(dá)，線粒體耗氧率明顯增強，表現(xiàn)為基礎(chǔ)呼吸增加和線粒體ATP的產(chǎn)生，結(jié)果表明糖代謝的重新編程伴隨著DPSCs的分化，可能在牙髓修復(fù)調(diào)控過程中扮演重要的角色。Wen 等[11]在比較SDF-1與G-CSF對DPSCs增殖、遷移和分化的影響時發(fā)現(xiàn)：2組DPSCs均有明顯地向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的潛能：表現(xiàn)出較高的ALP活性、較多的礦化結(jié)節(jié)及較多的DMP-1和牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)表達(dá)。

4.3 其他分化方向的能力 Li 等[29]發(fā)現(xiàn)：miR-143和miR-135抑制劑能夠誘導(dǎo)hDPSCs分化為骨骼肌細(xì)胞；從正常成人第三磨牙分離而來的DPSCs與5-Aza體外培養(yǎng)來誘導(dǎo)其向成肌細(xì)胞分化，結(jié)果顯示：miR-135 和miR-143的表達(dá)在被5-Aza誘導(dǎo)的DPSCs形成的成肌細(xì)胞中明顯減少，部分被miR-143和miR-135抑制劑處理的DPSCs表現(xiàn)出明顯的成肌細(xì)胞特性，共轉(zhuǎn)染miR-143和miR-135抑制因子的DPSCs成骨骼肌分化并分化后的細(xì)胞一半形成肌管。 Kim 等[30]發(fā)現(xiàn)：納米圖案化表面可以通過改變hDPSCs的外形與基因表達(dá)來增強其向成脂分化的能力，但同時抑制成牙本質(zhì)分化的能力。Chen 等[31]證明：從冷凍保存牙髓組織中提取的DPSCs不僅有向肝細(xì)胞樣分化的可行性，而且分化后的細(xì)胞具有正常的核型并且功能接近正常肝樣細(xì)胞。Westin等[32]使用泵(10 mL·min-1)把殼聚糖醋酸溶液加入到pH值為7.7且含有7% poloxamer 188的黃原膠水溶液中，機械攪拌、烘干消毒后制成支架。將無菌支架放置于24孔板中，加入含有100 μmoL·L-1kartogenin的成軟骨培養(yǎng)液使之充滿支架內(nèi)部空隙；使用注射器將DPSCs細(xì)胞懸液分4個不同區(qū)域注入支架內(nèi)部，確保DPSCs充滿整個支架內(nèi)部孔隙；細(xì)胞在孵箱內(nèi)孵育2 h后分別將2 mL成軟骨培養(yǎng)液加入24孔板內(nèi)防止細(xì)胞分離，培養(yǎng)14 d后分化為軟骨細(xì)胞。

5 問題與展望

自2000年來，國內(nèi)外學(xué)者在DPSCs的形態(tài)、生物特性和生物相容性[33-37]等方面進(jìn)行了詳盡的研究，最終取得了顯著的成果。Li 等[38]認(rèn)為：hDPSCs是一種很有前途的自體骨組織工程種子細(xì)胞并且目前已有臨床應(yīng)用的案例。DPSCs在骨組織工程學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，但向其他組織分化的研究仍在細(xì)胞和動物實驗階段。此外，DPSCs在臨床上獲取數(shù)量有限，用于臨床治療缺乏長期跟蹤報道，以上問題制約了DPSCs在臨床上應(yīng)用。未來的研究應(yīng)著眼于找尋DPSCs更具特異性的標(biāo)記物，對于DPSCs的培養(yǎng)方法也應(yīng)施行國際化規(guī)范，以便于確定其增殖和分化的程度。