李玉珠，龍 謀，湯艷燕，蔣 茜，杜木英,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué) 國(guó)家級(jí)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，中匈食品科學(xué)合作研究中心，重慶 400715）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa Linn.），又名山琉、洛神花、芙蓉煎，是錦奏科木槿屬一年生藥食兩用的草本植物，2004年被衛(wèi)生部和衛(wèi)計(jì)委列入新食品原料名單[1]，其原產(chǎn)地在非洲，中國(guó)引種成功后，目前在中國(guó)臺(tái)灣、廣西、廣東、福建均有分布，在云南南部具有相當(dāng)?shù)姆N植規(guī)模[2]。玫瑰茄花萼顏色鮮亮，富含花青素、多酚、黃酮等生物活性成分，具有抗癌、降血壓、降血脂和降血糖等保健功能[3-5]。相關(guān)研究表明，玫瑰茄花萼中有機(jī)酸含量較高，口感較酸，而其含有的有機(jī)酸種類和含量與其諸多的保健功能有著密切關(guān)系[6]；其含有的羥基檸檬酸（hydroxycitric acid，HCA）在抑制脂肪酸和脂肪合成、抑制食欲和降低體重方面具有良好功效，是天然減肥食品中的一種功能成分，而木槿酸是HCA的另一種存在形式，被認(rèn)為對(duì)治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病等疾病有一定的療效，是玫瑰茄中所特有的一種有機(jī)酸[7-9]；酚酸也是玫瑰茄的主要功能成分之一，具有抗氧化、抗癌、抗炎癥等作用。玫瑰茄花萼中還含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分[10]。

基于其營(yíng)養(yǎng)豐富、功能特異的特點(diǎn)，玫瑰茄花萼在食品領(lǐng)域有著較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。但是由于玫瑰茄口感較為尖酸，直接食用口感讓人難以接受，而目前以玫瑰茄花萼為原料的產(chǎn)品還較少，大部分為粗加工產(chǎn)品且還在試制中，玫瑰茄資源并未得到充分利用[11-12]。酒是人類生活中的主要飲料之一，隨著人們生活水平的提高及國(guó)家政策的調(diào)整，對(duì)低乙醇體積分?jǐn)?shù)、高營(yíng)養(yǎng)且具有保健功能的發(fā)酵酒的需求會(huì)越來(lái)越大?，F(xiàn)有的研究表明，若外加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將其進(jìn)行發(fā)酵，玫瑰茄將是釀酒的良好原料，且發(fā)酵過(guò)程會(huì)對(duì)其活性成分造成較大影響[13-14]。然而目前對(duì)玫瑰茄酒工藝及其活性成分的研究較少。本研究以我國(guó)云南產(chǎn)地的玫瑰茄干花萼為原料，采用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化探索了玫瑰茄浸提工藝及其酒發(fā)酵工藝的最佳條件，并測(cè)定了玫瑰茄酒中活性成分花青素和多酚含量，用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法比較了發(fā)酵前后其主要有機(jī)酸和酚酸含量的變化。本研究滿足了人們對(duì)天然健康食品的追求，有利于促進(jìn)玫瑰茄資源的開(kāi)發(fā)和利用，并為玫瑰茄酒的相關(guān)研究提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S1、S2、S3、S4、S5和S6為果酒釀造酵母，購(gòu)自安琪、拉曼德和Lalvin酵母公司；玫瑰茄干花萼購(gòu)自云南省昆明市中藥材市場(chǎng)。

福林-酚試劑 壇墨質(zhì)檢科技有限公司；緩沖液（B1、B2、B3和B4）、再生液（RG）、顯色液（R1和R2）、茚三酮緩沖液 日本和光公司；有機(jī)酸及酚酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%以上） 索萊寶生物科技有限公司；木槿酸和HCA標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%以上） 美國(guó)Sigma公司；KCl、HCl、CH3CO2Na·3H2O、HAc和Na2CO3等試劑（分析純） 廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型高HPLC儀、UV-2450S（E）型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀日本日立公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰茄釀制工藝

1.3.2 玫瑰茄花萼浸提條件優(yōu)化[15]

1.3.2.1 浸提條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

考慮到實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用，將玫瑰茄進(jìn)行全花萼浸提。選擇料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間作為影響因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。考察料液比對(duì)浸提效果的影響：選擇料液比（玫瑰茄-水）1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），浸提溫度75 ℃，浸提時(shí)間50 min；考察浸提溫度對(duì)浸提效果的影響：選擇最佳料液比1∶30，浸提溫度分別為45、65、75、85、95 ℃，浸提時(shí)間50 min；考察浸提時(shí)間對(duì)浸提效果的影響：在上述最佳單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸提時(shí)間分別為30、50、70、90 min。以浸提液花青素提取率和多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定各單因素最佳提取條件，計(jì)算如式（1）、（2）所示：

式中：C為花青素質(zhì)量濃度/（g/L）；D為多酚質(zhì)量濃度/（g/L）；V為玫瑰茄浸提液體積/L；M為玫瑰茄干花萼質(zhì)量/g；a為玫瑰茄干花萼水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，9.72%。

1.3.2.2 浸提條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在1.3.2.1節(jié)基礎(chǔ)上考慮各個(gè)因素的交互影響，以料液比（A）、浸提溫度（B）、浸提時(shí)間（C）3 個(gè)因素為響應(yīng)變量，以花青素提取率和多酚提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面三因素三水平試驗(yàn)方案，各因素及水平見(jiàn)表1。

表1 浸提條件響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table1 Level and code of independent variables used in Box-Behnken design for extraction optimization

1.3.3 玫瑰茄酒發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.3.1 玫瑰茄酒發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

在1.3.2節(jié)基礎(chǔ)上，將最優(yōu)浸提條件下得到的玫瑰茄浸提液作為發(fā)酵液，選擇酵母種類、酵母接種量、加糖量、發(fā)酵時(shí)間為影響因素，測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、花青素和多酚含量并結(jié)合感官評(píng)定，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。各單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：1）取200 mL玫瑰茄浸提液于錐形瓶中，調(diào)整其含糖量為25%，各浸提液中分別接種1.5 g/L活化好的S1、S2、S3、S4、S5和S6酵母，并在23 ℃發(fā)酵10 d后測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、花青素和多酚含量，并做感官評(píng)定（以下各單因素測(cè)定指標(biāo)同上）；2）選擇最優(yōu)酵母種類，含糖量為25%，酵母接種量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L，發(fā)酵溫度23 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 d；3）選擇最優(yōu)酵母種類及其接種量，調(diào)整浸提液含糖量分別為21%、23%、25%、27%、29%，發(fā)酵溫度23 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 d；4）在前面最優(yōu)酵母及其接種量和最優(yōu)含糖量基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度23 ℃，在發(fā)酵期間每天監(jiān)測(cè)玫瑰茄酒的發(fā)酵情況；5）在前面最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度分別為20、24、28、32 ℃。

1.3.3.2 玫瑰茄酒發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

表2 發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table2 Level and code of independent variables used in Box-Behnken design for fermentation optimization

在固定酵母種類和發(fā)酵時(shí)間基礎(chǔ)上選擇發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、加糖量（C）3 個(gè)因素為響應(yīng)變量，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、花青素含量及多酚含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方案，各因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 多酚和花青素總量的測(cè)定

多酚總量采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定，參照李升峰等[16]方法，略作修改。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.011 33x＋0.079 52，R2=0.999 7?；ㄇ嗨乜偭坎捎胮H值示差法測(cè)定，參照桑戈等[17]方法，略作修改。

1.3.4.2 有機(jī)酸含量的測(cè)定[18-20]

色譜條件：色譜柱Eclipse AAAC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫28 ℃，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量15 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相0.06 mol/L的KH2PO4溶液（用磷酸調(diào)pH 2.5）-甲醇體積比99∶1。將質(zhì)量濃度范圍為0.02～4.08 g/L的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)液、玫瑰茄浸提液（稀釋3 倍）及玫瑰茄酒經(jīng)0.45 μm水相微孔膜過(guò)濾后按照上述色譜條件進(jìn)樣。

1.3.4.3 酚酸含量的測(cè)定[19-20]

色譜條件為：色譜柱Eclipse AAAC18（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相A為2%冰乙酸水溶液，B為乙腈，洗脫程序如下：0～5 min，10% B；0～8 min，15% B；8～12 min，20% B；12～20 min，60% B；20～22 min，10% B。將質(zhì)量濃度范圍為2.0～160 mg/L的酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)液、玫瑰茄浸提液及玫瑰茄酒經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔膜過(guò)濾后按照上述色譜條件進(jìn)樣。

1.3.4.4 木槿酸和HCA的測(cè)定[20-22]

色譜條件：色譜柱Eclipse AAAC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫28 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量15 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相0.1%磷酸水溶液-甲醇體積比90∶10。將質(zhì)量濃度范圍為0.05～3.0 g/L的木槿酸和HCA混合標(biāo)準(zhǔn)液、玫瑰茄浸提液及玫瑰茄酒經(jīng)0.45 μm水相微孔膜過(guò)濾后按照上述色譜條件進(jìn)樣。

1.3.4.5 其他指標(biāo)的測(cè)定

乙醇體積分?jǐn)?shù)、可滴定酸、殘?zhí)?、揮發(fā)酸等指標(biāo)的測(cè)定均參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；氨基酸含量的測(cè)定參照呂樂(lè)福等[23]方法；總酯測(cè)定參照史靜霞等[24]方法。

1.3.4.6 玫瑰茄酒的感官評(píng)定

挑選15 名經(jīng)過(guò)感官評(píng)定培訓(xùn)的同學(xué)作為感官評(píng)定小組成員，參照GB/T 15038—2006中感官評(píng)定方法，從外觀、香氣、口感及風(fēng)格4 個(gè)方面對(duì)玫瑰茄酒進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果取平均值，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。

表3 玫瑰茄酒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table3 Criteria for sensory evaluation of roselle wine

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰茄浸提條件的優(yōu)化

2.1.1 玫瑰茄酒浸提條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 各因素對(duì)花青素及多酚提取率的影響Fig. 1 Effects of variables on the yield of anthocyanins and polyphenols

如圖1A所示，不同料液比對(duì)提取效果的影響效果存在顯著差異性（P＜0.05），花青素和多酚提取率隨溶劑用量的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，原因可能是當(dāng)溶劑用量較小時(shí)，溶液中花青素和多酚質(zhì)量濃度較高，不利于玫瑰茄中有效成分的溶出，而溶劑用量較小時(shí)，玫瑰茄內(nèi)部向表面?zhèn)鬟f的阻力占主導(dǎo)作用，從而降低了其溶出率[25]。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，花青素和多酚提取率達(dá)到最大值。如圖1B所示，延長(zhǎng)浸提時(shí)間可提高玫瑰茄中花青素和多酚的提取率，但當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到70 min時(shí)，滲透達(dá)到平衡，時(shí)間對(duì)浸提效果的影響不大，并且長(zhǎng)時(shí)間的水熱燜蒸狀態(tài)反而會(huì)使原料中的成分發(fā)生氧化[26]，從而使其提取率降低。因此，玫瑰茄浸提時(shí)間應(yīng)選擇70 min左右為宜。如圖1C所示，隨著溫度的升高，花青素和多酚的提取率不斷增加，在浸提溫度為85 ℃時(shí)花青素提取率達(dá)到最大值，多酚的提取率也較高，但當(dāng)溫度超過(guò)85 ℃時(shí)，花青素提取率出現(xiàn)了降低，這是因?yàn)橐环矫娓邷乜梢蕴岣呙倒迩阎谐煞值娜艹鏊俣龋硪环矫鏈囟冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致花青素的氧化降解[15]。

2.1.2 玫瑰茄浸提條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table4 Box-Behnken design with experimental yield of anthocyanins and polyphenols

表5 浸提條件回歸模型擬合結(jié)果Table5 Regression models predicting the extraction yield of anthocyanins and polyphenols

表4為玫瑰茄浸提條件響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果，表5為以花青素和多酚提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)式回歸方程，可知擬合模型效果顯著（P＜0.05）。為了驗(yàn)證方程的有效性，對(duì)該模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表6所示，可以看出，各影響浸提效果的因素間存在不同的交互作用。結(jié)合F值的大小，可知所選因素對(duì)花青素提取率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋毫弦罕龋冀釙r(shí)間＜浸提溫度；對(duì)多酚提取率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋航釡囟龋剂弦罕龋冀釙r(shí)間。

表6 回歸統(tǒng)計(jì)分析Table6 Analysis of variance of response surface regression models predicting the extraction yield of anthocyanins and polyphenols

圖2 各因素對(duì)花青素及多酚提取率影響的響應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of variables on the extraction yield of anthocyanins and polyphenols

從圖2可知，各響應(yīng)曲面的坡度較陡，說(shuō)明所選因素對(duì)響應(yīng)值的影響較大，且各因素間有較強(qiáng)的交互影響。通過(guò)以上模型預(yù)測(cè)得到的玫瑰茄最佳浸提工藝條件為：料液比1∶28.39、浸提溫度83.92 ℃、浸提時(shí)間78 min。在此浸提條件下預(yù)測(cè)得到的花青素提取率為0.0651%，多酚提取率為0.223%。

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，考慮實(shí)際條件情況，將玫瑰茄浸提工藝條件定為料液比1∶28、浸提溫度84.0 ℃、浸提時(shí)間78 min。在該條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，花青素提取率為（0.060±0.009）%，多酚提取率為（0.201±0.05）%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)的理論值相差不大，因此響應(yīng)面法對(duì)玫瑰茄浸提條件的優(yōu)化是可行的。該試驗(yàn)所得最優(yōu)浸提條件與前人文獻(xiàn)中報(bào)道的有所不同[15]，這可能與所選評(píng)價(jià)指標(biāo)的不同有關(guān)。

2.2 玫瑰茄酒發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 玫瑰茄酒發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 不同酵母菌種對(duì)發(fā)酵效果的影響

表7 不同菌種對(duì)發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Table7 Influence of starter cultures on the quality of roselle wine

如表7所示，各發(fā)酵液的乙醇體積分?jǐn)?shù)、花青素、多酚及還原糖含量存在顯著性差異（P＜0.05）。其中S1酵母發(fā)酵的乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著高于其他發(fā)酵菌種，但花青素和多酚含量較低，且在口感上較為苦澀；S5酵母發(fā)酵的乙醇體積分?jǐn)?shù)較高，但花青素含量顯著低于其他發(fā)酵菌種；S2、S6酵母發(fā)酵的乙醇體積分?jǐn)?shù)較低，感官得分也較低；而S4酵母發(fā)酵的酒中花青素和多酚含量均較高，感官得分最高，且乙醇體積分?jǐn)?shù)能達(dá)到10%以上，有利于發(fā)酵酒的保藏且口感較好，綜合考慮，選擇S4作為玫瑰茄發(fā)酵酒的發(fā)酵菌種。

2.2.1.2 酵母接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖3 酵母接種量對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、花青素及多酚含量的影響Fig. 3 Effects of yeast inoculum size on the concentrations of alcohol,reducing sugar, anthocyanins and polyphenols in roselle wine

由圖3可知，隨著酵母接種量的增加，發(fā)酵液乙醇體積分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，還原糖含量不斷減少，而花青素和多酚含量呈降低趨勢(shì)。當(dāng)酵母接種量達(dá)到1.5 g/L時(shí)，玫瑰茄酒的口感最佳，隨著酵母接種量的增多還原糖含量不斷降低，但乙醇體積分?jǐn)?shù)不再升高，說(shuō)明此時(shí)還原糖的消耗不再用于乙醇的產(chǎn)生而是用于酵母自身的生長(zhǎng)，當(dāng)酵母接種量超過(guò)1.5 g/L后，花青素含量顯著降低（P＜0.05），原因可能是酵母的增多使得花青素被大量消耗。綜上考慮，選擇酵母接種量1.5 g/L為中心點(diǎn)，在1.0～2.0 g/L之間進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1.3 加糖量對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖4可知，隨加糖量的增多還原糖含量不斷升高，乙醇體積分?jǐn)?shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，多酚含量呈上升趨勢(shì)，花青素含量略微升高。當(dāng)加糖量為23%時(shí)發(fā)酵液乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著高于其他發(fā)酵液（P＜0.05），所得玫瑰茄酒感官得分最高，當(dāng)加糖量超過(guò)23%時(shí)，高滲透壓可能抑制了酵母的活性[27]，乙醇體積分?jǐn)?shù)降低，因而選擇加糖量23%為優(yōu)化的中心點(diǎn)。

圖4 加糖量對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、花青素及多酚含量的影響Fig. 4 Effect of sucrose addition on the concentrations of alcohol,reducing sugar, anthocyanins and polyphenols in roselle wine

2.2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、花青素及多酚含量的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on the concentrations of alcohol,reducing sugar, anthocyanins and polyphenols in roselle wine

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷升高，還原糖、花青素和多酚含量不斷降低。在發(fā)酵前7 d乙醇體積分?jǐn)?shù)上升較快，之后上升比較緩慢，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí)，發(fā)酵液乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)10.7%左右，之后乙醇體積分?jǐn)?shù)不再增加且略有降低的趨勢(shì)，乙醇發(fā)酵趨于終點(diǎn)?；ㄇ嗨卦谇? d降低速度較快，之后含量有回升的趨勢(shì)，在發(fā)酵第10天時(shí)花青素含量達(dá)122.4 mg/L左右，之后含量略有降低。而多酚含量在第3天出現(xiàn)了升高，之后含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢降低。發(fā)酵液中花青素及多酚含量的降低可能與酵母的消耗和利用有關(guān)，這與Ifie等[14]的報(bào)道一致。通常果酒的發(fā)酵時(shí)間在7 d以上，在發(fā)酵前期發(fā)酵不完全，發(fā)酵液中乙醇含量較低，從第7天起對(duì)玫瑰茄酒做感官評(píng)價(jià)，玫瑰茄酒在發(fā)酵10 d后口感達(dá)到了最佳，綜上考慮，玫瑰茄酒的發(fā)酵時(shí)間選擇10 d為宜。

2.2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、花青素及多酚含量的影響Fig. 6 Effect of fermentation temperature on the concentrations of alcohol, reducing sugar, anthocyanins and polyphenols in roselle wine

如圖6所示，在24 ℃發(fā)酵時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值為（10.5±0.21）%，花青素和多酚也顯著高于其他溫度的含量（P＜0.05），所得玫瑰茄酒口感最好，故選擇發(fā)酵溫度24 ℃為中心點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。通常22～25℃是果酒酵母最適宜的生長(zhǎng)范圍，溫度越高，起酵快，發(fā)酵時(shí)間短，但酵母衰老快，反而導(dǎo)致乙醇體積分?jǐn)?shù)較低，并且高溫條件下?lián)]發(fā)性成分損失較多，腐敗微生物易繁殖生長(zhǎng)，使得發(fā)酵酒的品質(zhì)降低[28]。

2.2.2 玫瑰茄發(fā)酵酒工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以發(fā)酵溫度、酵母接種量、加糖量3 個(gè)影響玫瑰茄酒發(fā)酵的主要因素為響應(yīng)變量（以A、B和C來(lái)表示），以乙醇體積分?jǐn)?shù)、花青素質(zhì)量濃度及多酚質(zhì)量濃度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table8 Box-Behnken design with experimental values of alcohol,anthocyanin and polyphenol concentrations in roselle wine

2.2.2.2 工藝模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

表9 玫瑰茄酒回歸模型擬合結(jié)果Table9 Regression models predicting alcohol, anthocyanin and polyphenol concentrations in roselle wine

由表9可知，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、花青素及多酚質(zhì)量濃度為響應(yīng)值的數(shù)學(xué)擬合模型效果極顯著，R2分別為0.966 6、0.929 8及0.980 9，說(shuō)明該模型擬合度較好，該試驗(yàn)方法可靠，可用于預(yù)測(cè)和分析玫瑰茄發(fā)酵酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)、花青素及多酚含量。

表10 回歸統(tǒng)計(jì)分析Table10 Analysis of variance of response surface regression models predicting alcohol, anthocyanin and polyphenol concentrations in roselle wine

為了驗(yàn)證方程的有效性，對(duì)該模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表10所示，各發(fā)酵因素對(duì)3 個(gè)響應(yīng)值存在不同的交互作用的影響。結(jié)合F值的大小，可知所選因素對(duì)玫瑰茄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＜加糖量＜酵母接種量；對(duì)玫瑰茄酒花青素含量的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋航湍附臃N量＜加糖量＜發(fā)酵溫度；對(duì)玫瑰茄酒多酚含量的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＜酵母接種量＜加糖量。

2.2.2.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

圖7 各因素對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、花青素及多酚含量影響的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plots showing the interactive effects of variables on alcohol, anthocyanin and polyphenol concentrations

從圖7可直觀看出，發(fā)酵溫度、酵母接種量及加糖量對(duì)玫瑰茄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)和花青素質(zhì)量濃度有較大影響，并且各因素之間有較顯著的交互作用，表現(xiàn)為響應(yīng)面的坡度較陡。而響應(yīng)值為多酚質(zhì)量濃度的曲面坡度較為平緩，說(shuō)明各因素對(duì)多酚含量的影響稍弱。

由于本試驗(yàn)主要關(guān)注玫瑰茄中的主要功能成分花青素和多酚含量在發(fā)酵過(guò)程中能夠得到最大程度的保留，并且最終乙醇體積分?jǐn)?shù)能達(dá)到10%以上，因而選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)的重要性為3，花青素及多酚質(zhì)量濃度的重要性分別為5，乙醇體積分?jǐn)?shù)目標(biāo)值為10.0%～12.0%的最大響應(yīng)值，花青素目標(biāo)質(zhì)量濃度為115.47～200 mg/L的最大響應(yīng)值，多酚目標(biāo)質(zhì)量濃度為358.19～600mg/L的最大響應(yīng)值，在此條件下該模型預(yù)測(cè)得到的玫瑰茄酒最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度24.81 ℃、酵母接種量1.6 g/L、加糖量22.64%。在此發(fā)酵條件下預(yù)測(cè)得到的玫瑰茄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為10.63%，花青素質(zhì)量濃度為125.17 mg/L，多酚質(zhì)量濃度為621.33 mg/L。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)模型預(yù)測(cè)，考慮實(shí)際條件情況，將玫瑰茄酒發(fā)酵的最佳工藝條件定為：發(fā)酵溫度24.5 ℃、酵母接種量1.6 g/L、加糖量22.5%。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，得到的實(shí)際值與預(yù)測(cè)的理論值相差不大，因此響應(yīng)面法對(duì)玫瑰茄花酒發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行的。

2.4 玫瑰茄酒主要品質(zhì)指標(biāo)及其有機(jī)酸類成分測(cè)定結(jié)果

2.4.1 玫瑰茄酒主要指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表11 玫瑰茄酒中的氨基酸種類及相對(duì)及酚酸含量Table11 Amino acid composition of roselle wine

經(jīng)檢測(cè)，在最佳工藝條件下發(fā)酵得到的玫瑰茄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為（10.6±0.12）%，花青素質(zhì)量濃度為（121.25±0.35）mg/L，多酚質(zhì)量濃度為（629.58±0.22）mg/L，可滴定酸質(zhì)量濃度為8.06 g/L（以酒石酸計(jì)），還原糖質(zhì)量濃度為（14.47±0.19）g/L，總酯質(zhì)量濃度為（1.97±0.20）g/L，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度為（0.84±0.12）g/L，感官得分為89.57±2.25。玫瑰茄酒中氨基酸種類齊全，各氨基酸種類及相對(duì)含量如表11所示，玫瑰茄酒中共檢出16 種氨基酸（組氨酸未檢出），總質(zhì)量濃度為（67.32±0.32）mg/L，脯氨酸是玫瑰茄酒中的主要氨基酸，其含量占氨基酸總量的60.15%，而具有刺激系統(tǒng)、緩解慢性疲勞的酪氨酸占氨基酸總量的15.87%，此外，除色氨酸以外的7 種必需氨基酸占氨基酸總量的10.85%。

2.4.2 有機(jī)酸及酚酸測(cè)定結(jié)果

表12 玫瑰茄浸提液及其發(fā)酵酒中各有機(jī)酸含量Table12 Organic acid composition of water extract from roselle and wine

如表12所示，玫瑰茄浸提液中共檢測(cè)出7種有機(jī)酸，主要的有機(jī)酸為檸檬酸和木槿酸，這與張賽男等[2]的報(bào)道一致，其含量占有機(jī)酸總量的59.05%，而木槿酸和HCA占有機(jī)酸總量的30.00%。玫瑰茄酒中的主要有機(jī)酸為乳酸和木槿酸，占總有機(jī)酸含量的55.26%，而檸檬酸在發(fā)酵過(guò)程中大幅度降低，因而玫瑰茄的尖酸感得到了較大的緩和，與其浸提液相比玫瑰茄酒酸度較柔和，玫瑰茄酒中槿酸和HCA含量與浸提液相比有所降低，占有機(jī)酸總量的24.58%，而乳酸、琥珀酸及丙酮酸的含量升高可能是因?yàn)榻湍妇陌l(fā)酵作用造成的[29]。此外在玫瑰茄浸提液及其發(fā)酵酒中均未檢出乙酸。

玫瑰茄浸提液中含有除肉桂酸以外的8 種酚酸，原兒茶酸含量最高，占酚酸總量的39.15%，這與Borrás-Linares等[30]報(bào)道的玫瑰茄中主要含有羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸類等酚酸相符。在發(fā)酵過(guò)程中原兒茶酸、綠原酸、龍膽酸、咖啡酸及阿魏酸含量有一定程度的降低，而沒(méi)食子酸、丁香酸和香豆酸的含量升高，這與IFIE等[14]報(bào)道的玫瑰茄酒發(fā)酵過(guò)程中咖啡酸含量有所升高不同，可能與玫瑰茄種類及玫瑰茄酒發(fā)酵條件的不同有關(guān)。

3 結(jié) 論

玫瑰茄最優(yōu)浸提工藝為料液比1∶28、浸提溫度84.0 ℃、浸提時(shí)間78 min，優(yōu)化后的浸提工藝可使玫瑰茄花青素提取率為（0.060±0.009）%，多酚提取率為（0.201±0.05）%。玫瑰茄酒的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度24.5 ℃、S4酵母接種量1.6 g/L、加糖量22.5%，在最優(yōu)發(fā)酵條件下所得玫瑰茄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為（10.6±0.12）%，花青素質(zhì)量濃度為（121.25±0.35）mg/L，多酚質(zhì)量濃度為（629.58±0.22）mg/L。木槿酸、檸檬酸和原兒茶酸是玫瑰茄浸提液中的主要有機(jī)酸和酚酸，在發(fā)酵過(guò)程中，各有機(jī)酸和酚酸含量發(fā)生了不同程度的升高和降低，其中檸檬酸含量顯著降低，而沒(méi)食子酸、丁香酸和香豆酸等酚酸的含量得到了提高。玫瑰茄酒中的主要的有機(jī)酸為乳酸和木槿酸，原兒茶酸仍為其主要的酚酸。所得玫瑰茄酒保留了其特有的木槿酸、HCA、酚酸、花青素等功能成分，氨基酸種類齊全，具有一定的保健功效，各主要指標(biāo)均符合果酒標(biāo)準(zhǔn)，其顏色鮮亮透明，酸甜適宜，滿足人們對(duì)天然、健康食品的追求，具有良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)潛能。

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