江 波 金從國 楊承綱 涂長玲 朱 穎 何文杰 劉 坤

(云南省腫瘤醫(yī)院,云南 昆明 650118)

肺癌病死率居所有惡性腫瘤之首〔1〕。臨床研究顯示，無論是在治療原發(fā)病灶前還是切除原發(fā)灶后，甚至包括在治療后復發(fā)的腫瘤患者體內(nèi)都可檢測到循環(huán)腫瘤細胞(CTC)〔2,3〕。腫瘤細胞中存在表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導通路，如EGFR過度表達，EGFR突變等的異常，從而促進細胞不斷增殖并抑制其凋亡，導致生長調(diào)節(jié)失控〔4〕。肺癌的分子靶向治療中EGFR是目前研究最多的肺癌治療靶點且相應的藥物已進入臨床。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)已經(jīng)成為晚期非小細胞肺癌(NSCLC)一種有效的治療手段。尤其在老年患者中，EGFR-TKI相對化療具有更大的優(yōu)勢。本研究以老年晚期NSCLC為研究對象，以外周血CTC為載體，探討外周血CTC的EGFR表達水平與EGFR-TKI類藥物療效及預后之間的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 篩選云南省腫瘤醫(yī)院2012年9月至2014年12月收治且經(jīng)病理組織學診斷的老年晚期NSCLC患者48例為研究對象，男36例，女12例；年齡60～78(平均71歲)；病理類型：腺癌36例，鱗癌12例；TNM分期：ⅢB期6例，Ⅳ期42例；功能狀態(tài)(PS)評分0～1分36例，≥2分12例。治療前后均行胸腹部CT、彩超、顱腦MRI、心電圖、血常規(guī)、血生化及腫瘤標志物檢查。

1.2治療方法 根據(jù)醫(yī)生經(jīng)驗從以下3種EGFR-TKI中任選一種。吉非替尼片(阿斯利康公司)使用劑量為每次250 mg,口服，1次/d；厄洛替尼片(美國羅氏公司)使用劑量為每次150 mg,口服，1次/d；鹽酸?？商婺崞?浙江貝達藥業(yè)公司)使用劑量為每次125 mg,口服，3次/d。無論選擇何種藥物均至少服用1個月。

1.3實驗方法

1.3.1標本采集 48例患者在治療前后均從肘正中靜脈采血5 ml,治療前隨機選取5例患者另采血20 ml，所有血液標本加入肝素抗凝混勻，并在采集后2 h內(nèi)進行檢測。

1.3.2抗體及試劑 CD45-PC5、CK18-FITC、EGFR-PE、NH4Cl溶血素，均購于美國Beckman Coulter公司。流式細胞儀EPICS XL(美國Beckman Coulter公司)。

1.3.3分選CD45-CK18+細胞 利用流式細胞技術(FCM)將5例20 ml外周血每份分成20份加入5 ml的無菌試管中，每管1 ml；每管加入CD45-PC5、CK18-FITC各200 μl，避光保存30 min;加入NH4Cl溶血素4 ml，反復溶血，直到液體透亮，離心后加入培養(yǎng)液待分選；消毒ALTRA流式室，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度8℃左右，打開流式細胞儀，進行分選細胞數(shù)接近1 000個結束。

1.3.4確定CD45-CK18+細胞為外周血CTC 將分選的CD45-CK18+細胞用玻片收集微球后置于光學顯微鏡下進行觀察有無惡性腫瘤細胞的特征。

1.3.5CTC中EGFR的檢測 將48例治療前后的96個5 ml標本分別加入20 μl CD45-PC5、20 μl EGFR-PE和20 μl CK18-FITC,加入肝素抗凝的全血100 μl，搖勻后避光室溫保存30 min然后加入NH4Cl溶血素2 ml溶血，15 min后上機檢測，表達CD45-CK18+的細胞為患者外周血殘留的CTC,表達CD45-CK18+EGFR+的細胞為CTC的EGFR陽性細胞。

1.4療效評價 按WHO實體瘤評價標準分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)，疾病進展(PD),CR+PR為總有效，CR+PR+SD為控制。無進展生存期(PFS)指自治療首日至病變進展日；總生存期(OS)為自治療首日至死亡日或失訪日，均以月計算。隨訪結止2015年10月。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t、χ2檢驗，Kaplan-Meier法,Log rank法檢驗。

2 結 果

2.1確定外周血CTC 選取的5例外周血中均分選出CD45-CK18+細胞，染色后置于光學顯微鏡下觀察，具備惡性腫瘤細胞的特征：細胞核染色加深，染色質變粗，核質比例增大，可確定CD45-CK18+細胞為外周血CTC，見圖1。

圖1 老年NSCLC患者外周血CTC(HE，×400)

2.2CTC的EGFR表達水平與臨床因素的關系 在48例治療前的標本中，EGFR表達水平在不同性別(男23.54±11.8，女26.25±14.3)、臨床分期(ⅢB 19.65±2.0，Ⅳ 24.9±13.2)、PS評分(0～1分 26.11±13.4，≥2分 21.61±11.3)間無統(tǒng)計學差異(t=0.840,P=0.404;t=0.795、P=0.430;t=1.351,P=0.182)，EGFR表達水平在不同組織類型之間有統(tǒng)計學差異(鱗癌17.47±2.9，腺癌36.93±4.7，t=3.264,P=0.001)。

2.3CTC的EGFR表達水平與TKI療效的關系 本組48例患者中，1例CR，19例PR,9例SD,19例PD,總有效率為41.7%(20/48)，疾病控制率為60.4%(29/48)；EGFR表達值介于5.4～50，以中位數(shù)21.4作為界定值，大于中位數(shù)的定義為EGFR高表達(20例)，小于中位數(shù)的定義為EGFR低表達(28例)。EGFR高表達組(EGFR水平為35.62±13.4)的總有效率(50.0%，CR 1例，PR 9例，SD 4例，PD 6例)與低表達組(EGFR水平為 14.23±7.6)的總有效率有統(tǒng)計學差異(35.7%，CR 0例，PR 10例，SD 5例，PD 13例，χ2=11.465,P=0.009)。EGFR高表達組疾病控制率(70.0%)與低表達組有統(tǒng)計學差異(53.6%,χ2=0.698,P=0.007)。

2.4治療前后CTC的EGFR表達水平的變化 本組48例患者中，治療有效的29例患者CTC的EGFR表達水平治療前后有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；治療無效的19例患者CTC的EGFR表達水平治療前無顯著變化(P>0.05)，見表1。

表1 治療前后CTC的EGFR表達水平比較

2.5CTC的EGFR表達水平與生存期的關系 本組病例OS為15個月，1年生存率為60.6 %，2年生存率為33.3%，3年生存率為12.1%。EGFR高表達組和低表達組，中位OS分別為21個月和10個月，1年生存率分別為77.8%和63.3%；2年生存率分別為38.1%和31.2%；3年生存率分別為22.2%和3.3%。經(jīng)Log rank檢驗，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，見圖2。本組病例中位PFS為6個月。EGFR高表達組和低表達組中位PFS分別為11個月和4個月；經(jīng)Log rank檢驗，兩組比較差異顯著(P=0.001)，見圖3。

圖2 老年晚期NSCLC患者CEC EGFR表達水平與OS的關系

圖3 老年晚期NSCLC患者CEC的EGFR表達水平與PFS的關系

3 討 論

EGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族成員，在大多數(shù)NSCLC中表達上調(diào)，是治療NSCLC的一個重要靶點。臨床研究證實〔5～7〕，EGFR突變型患者對EGFR-TKI類藥物的有效率可達65%～83%，而野生型患者僅為10%～15%。因此，NCCN指南已把EGFR基因突變陽性作為使用EGFR-TKI藥物的先決條件。常用的EGFR突變檢測方法有：測序法，PCR-SSCP，突變體富集PCR，ARMS，微數(shù)字PCR，HRM，DHPLC等，但每種檢測法均依賴于組織標本〔8～10〕。目前多數(shù)NSCLC中EGFR基因突變檢測均以手術切除的肺癌組織作為研究材料，這類患者多因屬于早期還未列入靶向治療的范疇，而晚期尤其老年患者很難獲得足量的組織標本進行EGFR基因檢測，因此國內(nèi)外都缺乏這方面的大樣本臨床資料。Punnoose等〔11〕發(fā)現(xiàn)接受EGFR-TKI治療的NSCLC患者的CTC攜帶的基因信息與腫瘤組織具有高度一致性并證實了通過CTC檢測EGFR的可能性。

目前關于EGFR的表達是否對NSCLC靶向治療有指導意義仍有爭論，針對CTC及組織標本進行EGFR突變檢測的研究較多，但針對EGFR蛋白表達水平進行相關性研究的國內(nèi)外報道極少。對EGFR表達與腫瘤分期、淋巴結轉移等NSCLC臨床病理特征的關系也有爭論。本研究顯示無論是組織的蛋白突變檢測還是蛋白表達檢測均提示EGFR腺癌表達水平高于鱗癌，EGFR高表達患者的療效及疾病控制率均明顯優(yōu)于EGFR低表達的患者，說明依據(jù)CTC的EGFR表達水平來選擇TKI類藥物是可行的，該種方法可能對于組織突變檢測無法進行的老年患者是一種有效的補充。本研究是以中位數(shù)作為區(qū)分高低表達的界限，對臨床TKI藥物的選擇具有一定的參考價值，且本研究還顯示CTC的EGFR變化水平可能是TKI療效的預測指標。

有研究〔12〕顯示EGFR蛋白表達與基因突變之間不存在一致性。但也有研究顯示服用EGFR-TKI的患者，蛋白高表達組生存期要比低表達組長〔13〕。本研究表明CTC的EGFR高表達的老年患者能有更長的OS及PFS。晚期NSCLC的一線治療中，有40%～50%患者能從TKI治療中獲益。如何從無法獲取組織標本的這部分老年患者中篩選出適合TKI治療的患者是臨床醫(yī)生所面臨的問題。本研究提示通過檢測外周血CTC的EGFR表達水平，有助于臨床篩選適合接受TKI治療的老年患者，從而提高藥物療效，避免不必要的經(jīng)濟損失和減輕藥物的不良反應。

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