時(shí) 愔 楊 華 王開(kāi)化 王 勇

(黔西南州中醫(yī)院骨科，貴州 興義 562400)

脊髓損傷(SCI)是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，且預(yù)后效果也差〔1，2〕。研究表明，相比一般性的外傷，中樞神經(jīng)的損傷與免疫失能更加有相關(guān)性〔3，4〕。研究表明，SCI的急性階段會(huì)影響CD4+T細(xì)胞的效應(yīng)功能〔5〕。然而，處于SCI慢性階段是否會(huì)影響T細(xì)胞的功能，目前還少見(jiàn)報(bào)道。本研究探討慢性SCI時(shí)外周CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)的變化。

1 材料與方法

1.1小鼠 年齡相仿的雌性C57BL/6小鼠購(gòu)買于Jackson實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)小鼠年齡3～8個(gè)月，分為CT組及SCI組，每組15只。

1.2SCI處理 采用Infinite Horizon Impactor誘導(dǎo)。取3～4個(gè)月的小鼠腹腔注射ketamine(100 mg/kg)和xylazine(10 mg/kg)進(jìn)行麻醉。在小鼠胸椎第九節(jié)進(jìn)行椎板切除術(shù)，將脊髓暴露出來(lái)，用70 kdyn的力進(jìn)行損傷。術(shù)后小鼠通過(guò)每日皮下注射乳酸林格液防止體液損失，慶大霉素(40 mg/kg)來(lái)預(yù)防尿道感染。

1.3脾臟細(xì)胞分離 麻醉小鼠后取出脾臟，將脾臟磨勻，使用200目的尼龍膜使之成為單細(xì)胞懸液。300 r/min離心5 min后加入1 ml紅細(xì)胞裂解液乙酸激酶(ACK)，室溫中處理5 min，再加入3倍體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)中和。

1.4阻斷PD-1實(shí)驗(yàn) 取1×106脾臟細(xì)胞，加入1 ml T細(xì)胞培養(yǎng)基，將10 μg/ml阻斷抗體抗-PD-1抗體(Biolegend SanDiego,CA)或10 μg/ml鼠IgG2a Isotype同型對(duì)照抗體(Biolegend SanDiego,CA)加入，同時(shí)加入25 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素刺激，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h。

1.5流式細(xì)胞術(shù)分析樣品的制備 將分離得到的脾臟細(xì)胞加入1 ml T細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入25 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素，37°細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激0.5 h后加入brefeldinA，繼續(xù)培養(yǎng)4.5 h。收樣，標(biāo)記抗體。先標(biāo)記表面抗體，固定后再破膜標(biāo)記細(xì)胞因子:①表面抗體標(biāo)記：將細(xì)胞重懸在200 μl PBS中，按照1×106個(gè)細(xì)胞標(biāo)2 μl流式抗體量來(lái)標(biāo)記抗體。置于4℃冰箱中避光孵育25 min，用1 ml PBS洗1～2次。②細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞因子標(biāo)記：使用ebioscience公司胞質(zhì)與核固定液，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行固定與標(biāo)記。

1.6儀器與試劑 T細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI)流式分析儀器：BD公司的Calibure流式熒光抗體，ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Biolegend公司。

2 結(jié) 果

2.1兩組小鼠脾臟總細(xì)胞數(shù)、T細(xì)胞總數(shù)與CD8+T細(xì)胞總數(shù)比較 CT組脾臟重量及細(xì)胞總數(shù)與SCI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.35，0.28)。SCI組脾臟中T細(xì)胞數(shù)(P=0.39)及CD8+T細(xì)胞數(shù)與CT組比較差異方無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.41)。見(jiàn)表1。

2.2SCI小鼠中CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子 相比CT組，SCI組IFNγ ，TNF-α，GranzymeB，Perforin均顯著下降。見(jiàn)表2，表3。

2.3兩組CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)比較 SCI組CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1的水平顯著上升〔SCI組(9.3±1.5)×106個(gè)，CT組(5.2±0.9)×106個(gè)，P<0.01〕，PD-1表達(dá)的比例也上升〔SCI組(5.8±1.1)%，CT組 (4.2±0.6)%，P<0.01〕。

2.4阻斷CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)可以恢復(fù)其細(xì)胞因子分泌能力 加入阻斷抗體抗PD-1抗體后，CD8+T細(xì)胞所分泌的IFNγ、TNF-α、GranzymeB均得到顯著升高，但Perforin差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.21，P=0.17)。見(jiàn)圖1。

表1 兩組小鼠脾臟總細(xì)胞數(shù)，T細(xì)胞總數(shù)，CD8+T細(xì)胞數(shù)水平比較

表2 流式細(xì)胞術(shù)分析兩組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平

與SCI組比較：1)P<0.05;下表同

表3 ELISA分析兩組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平

圖1 阻斷CD8+T細(xì)胞PD-1后其細(xì)胞因子分泌能力

3 討 論

T細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控機(jī)體對(duì)抗病原體的感染〔6〕。IFNγ在多種免疫應(yīng)答中發(fā)揮中重要調(diào)節(jié)作用，包括激活巨噬細(xì)胞，調(diào)控組織相容性抗原Ⅰ和Ⅱ的抗原提呈作用，招募淋巴細(xì)胞，還有CD4輔助性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答及抑制病毒復(fù)制等。在慢性SCI患者中，降低IFNγ的產(chǎn)生，對(duì)于其抗感染能力下降有關(guān)聯(lián)〔7〕。TNF在機(jī)體炎癥與對(duì)病原體的細(xì)胞毒反應(yīng)都有重要作用〔8〕。在病毒感染中，CD8+T細(xì)胞分泌的TNF-α對(duì)于被感染的細(xì)胞凋亡與裂解具有重要作用〔9,10〕。因此，T細(xì)胞無(wú)法正常分泌TNF-α，可能是SCI誘導(dǎo)免疫缺陷的一個(gè)原因。研究發(fā)現(xiàn)，TNF還對(duì)生發(fā)中心的形成及引發(fā)機(jī)體體液免疫中有重要作用〔11〕。T細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的失常，也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法正常行使抗體的免疫反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞分泌的GranzymeB可以殺傷腫瘤細(xì)胞。除了殺傷靶細(xì)胞，它們同時(shí)可以殺死胞內(nèi)的病原體，殺死細(xì)菌，還可以抑制病毒的復(fù)制；還可以與Perforin協(xié)同發(fā)揮免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞功能的損傷與其表達(dá)PD-1水平升高有關(guān)系，體外阻斷PD-1表達(dá)后，可以恢復(fù)CD8+T細(xì)胞分泌IFNγ、GranzymeB、Perforin等細(xì)胞因子的能力。說(shuō)明PD-1的高表達(dá)與慢性SCI誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞失能相關(guān)。

1Hitzig SL,Eng JJ,Miller WC,etal.An evidence-based review of aging of the body systems following spinal cord injury〔J〕.Spinal Cord,2011;49(6):684-701.

2Lidal IB,Snekkevik H,Aamodt G,etal.Mortality after spinal cord injury in Norway〔J〕.J Rehabil Med,2007;39(2):145-51.

3Meisel C,Schwab JM,Prass K,etal.Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome〔J〕.Nat Rev Neurosci,2005;6(1):775-86.

4Kawli T,He F,Tan MW.It takes nerves to fight infections:insights on neuro-immune interactions from C elegans〔J〕.Dis Model Mech,2010;3(11-12):721-31.

5Held KS,Steward O,Blanc C,etal.Impaired immune responses following spinal cord injury lead to reduced ability to control viral infection〔J〕.Exp Neurol,2010;226:242-53.

6Slifka MK,Whitton JL.Antigen-specific regulation of T cell-mediated cytokine production〔J〕.Immunity,2000;12(5):451-7.

7Schoenborn JR,Wilson CB.Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses〔J〕.Adv Immunol,2007;96(1):41-101.

8Bradley JR.TNF-mediated inflammatory disease〔J〕.J Pathol,2008;214(2):149-60.

9Chávez-Galán L,Arenas-Del Angel MC,Zenteno E,etal.Cell death mechanisms induced by cytotoxic lymphocytes〔J〕.Cell Mol Immunol，2009;6(1):15-25.

10Kuwano K,Kawashima T,Arai S.Antiviral effect of TNF-alpha and IFN-gamma secreted from a CD8+ influenza virus-specific CTL clone〔J〕.Viral Immunol,1993;6(11):1-11.

11Gelinck LB,van der Bijl AE,Beyer WE,etal.The effect of anti-tumour necrosis factor alpha treatment on the antibody response to influenza vaccination〔J〕.Ann Rheum Dis,2008;67(5):713-6.