李家樹 史家欣 胡 蓉 趙新成 梁程程

(連云港市第一人民醫(yī)院 徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院 南京醫(yī)科大學連云港臨床醫(yī)學院呼吸內科，江蘇 連云港 222002)

肺癌的發(fā)生、發(fā)展主要是癌基因的激活和抑癌基因的失活，導致細胞惡性增殖，凋亡率下降〔1～3〕。酪氨酸激酶(JAK)-信號轉導及轉錄激活因子(STAT)信號轉導通路在細胞增殖、生長、轉化和遷移等過程中發(fā)揮重要作用〔4,5〕。α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490)是一種JAK家族激酶的選擇性抑制劑，能通過阻斷JAK-STAT信號轉導通路進而有效抑制細胞的增殖，并促進其凋亡〔6〕。本研究旨在探討AG490對肺癌細胞Lewis增殖、凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 Lewis肺癌細胞株購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，AG490、噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，STAT3抗體、STAT5抗體、Survivin抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的兔二抗購自美國Cell Signaling Technology公司、蛋白提取試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2細胞培養(yǎng) 將Lewis肺癌細胞復蘇后接種于RPMI1640培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)于37℃、5% CO2、相對濕度10%的恒溫培養(yǎng)箱中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，待細胞融合度達到70%～80%時，用胰酶消化、傳代。

1.3MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)期的Lewis細胞，胰酶消化至濃度為1×106/ml接種于96孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞全部貼壁并鋪滿96孔板底部時，棄去培養(yǎng)液，分別加入100 μl不同濃度的AG490溶液(0、20、40、80、160 μmol/L)，每組設5個復孔，以0 μmol/L為空白對照，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后，棄去藥物。每孔加20 μl 5 mg/ml MTT溶液，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，震蕩混勻，用酶標儀測定波長490 nm處的吸光值(OD值)。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，試驗重復3次。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的Lewis細胞，胰酶消化至濃度為1×106/ml接種于6孔板上，待細胞鋪滿6孔板底部70%～80%時，棄去培養(yǎng)基，分別加入上述0、40、80 μmol/L AG490溶液，在恒溫箱中培養(yǎng)24和48 h后，棄去培養(yǎng)基和AG490溶液，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，并收集1×106～5×106/ml細胞，加入5 μl PI 和5 μl Annexin V-FITC混合液，振蕩混勻，避光孵育5～15 min，采用流式細胞儀測定各組細胞的凋亡情況，實驗重復3次。

1.5Western印跡檢測細胞中STAT3、STAT5、Survivin蛋白表達 取0、80 μmol/L AG490溶液處理的細胞，培養(yǎng)48 h，按細胞中蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白質的濃度，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，變性，備用。將10%分離膠、5%濃縮膠、1倍電泳液置于電泳槽內，上樣，先在60 V電壓30 min，后100 V電壓90 min，當溴酚藍到達膠的盡頭時停止電泳，切除濃縮膠和溴酚藍部分，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，Tris緩沖液(TBST)漂洗5 min后置于封閉液中，室溫下緩慢振蕩90 min，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，孵育2 h，TBST洗滌3次，加入電化學發(fā)光(ECL)顯色液，用凝膠成像儀掃描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表達量，實驗重復3次。

1.6統(tǒng)計學分析 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度AG490和不同作用時間對細胞增殖的影響 當AG490作用24、48 h，與0 μmol/L組相比，20、40、80、160 μmol/L組細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當作用24、48 h，40、80、160 μmol/L組顯著高于20 μmol/L組(P<0.05)；40 μmol/L組與80、160 μmol/L組差異顯著(P<0.05)。當藥物濃度相同，由于作用時間不同，0 μmol/L組間差異不顯著(P>0.05)，20 μmol/L和40 μmol/L組間差異顯著(P<0.05)，80 μmol/L和160 μmol/L組間的差異不顯著(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度AG490和不同作用時間對細胞增殖抑制率的影響

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05；與20 μmol/L組比較：2)P<0.05；與40 μmol/L比較：3)P<0.05；與同濃度24 h比較：4)P<0.05

2.2流式細胞術檢測AG490對細胞凋亡的影響 AG490作用24、48 h，當作用時間相同，40、80 μmol/L組細胞凋亡率顯著高于0 μmol/L組，80 μmol/L組顯著高于40 μmol/L組(P<0.05)；當濃度相同時，40、80 μmol/L組作用24 h的細胞凋亡率顯著低于48 h(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度AG490和不同作用時間對細胞凋亡的影響

與0 μmol/L組比較:1)P<0.05；與40 μmol/L組比較:2)P<0.05；與同濃度24 h比較:3)P<0.05

2.3Western印跡檢測細胞中STAT3、STAT5、Survivin蛋白表達 AG490干預48 h時，80 μmol/L 組STAT3(0.164±0.032)、STAT5(0.183±0.071)、Survivin(0.305±0.040)的表達量均顯著低于0 μmol/L組(0.357±0.048，0.395±0.068，0.834±0.082，P<0.05)。見圖1。

圖1 AG490對細胞中STAT3、STAT5、Survivin蛋白表達的影響

3 討 論

正常情況下，JAK/STAT信號通路表達量較低，但在機體病變組織中被異常激活而高表達〔7〕。在腫瘤組織中，細胞惡性增殖激活JAK蛋白磷酸化和信號轉導途徑，從而使STAT蛋白磷酸化，形成的同源二聚體與細胞核中相應靶基因結合發(fā)揮調控作用〔8〕。JAK/STAT信號轉導通路對細胞增殖、分化、凋亡及免疫調節(jié)等過程發(fā)揮重要作用〔9〕。AG490主要通過競爭性結合JAK結合位點，阻斷JAK2蛋白磷酸化和STAT3蛋白活化，影響JAK/STAT信號通路，抑制細胞增殖〔10,11〕。研究證明，AG490可以特異性阻斷JAK/STAT信號轉導途徑，被認為能抑制細胞增殖和降低細胞侵襲力，從而控制腫瘤的發(fā)展〔12〕。有研究證實，AG490是JAK2特異性阻斷劑，可抑制結腸癌、乳腺癌、肝癌細胞的增殖〔13,14〕。STAT3和STAT5是細胞內重要的信號轉導因子，活化后對細胞的生長、凋亡、轉化等過程起重要作用〔15〕。研究證明，STAT3在多種腫瘤組織和細胞中呈現(xiàn)異常表達，高表達的STAT3對細胞增殖、侵襲等過程起關鍵作用，抑制STAT3可阻斷該通路上、下游的致癌基因和致癌因子〔16～18〕。STAT5在頭頸部鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、白血病等異常表達，受多種生長因子和細胞因子的刺激而活化，與相應靶基因結合從而影響腫瘤的發(fā)生、演進過程〔19，20〕。本實驗結果說明JAK/STAT信號通路抑制劑AG490誘導肺癌細胞凋亡，阻礙肺癌的發(fā)生和發(fā)展；AG490可能通過阻礙STAT3、STAT5的活性，抑制下游靶基因Survivin蛋白的表達量而誘導肺癌細胞的凋亡。

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