朱云波 李佳佳 高燕軍 胡亞軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

急性缺血性腦梗死唯一有效的治療方法為早期及時的溶栓治療〔1〕，重組組織型纖溶酶原激活物(r-tPA)治療急性腦梗死有效，是目前急性腦梗死溶栓治療的根本治療藥物〔2〕，急性腦梗死溶栓治療的時間窗為3 h，但絕大多數(shù)患者會失去3 h的溶栓時間窗，近年來提出超時間窗溶栓治療〔3，4〕，Ogata等〔5〕研究將溶栓治療時間延長到6 h。本文對急性腦梗死大鼠進行梗死后6 h溶栓治療，探討超時間窗溶栓治療對急性腦梗死大鼠的腦保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：健康、雄性、清潔級、10周齡、重290～330 g的Wistar大鼠60只。主要試劑：2，3，5-氯化三苯基四氮唑、兔抗大鼠CD34(美國Sigma公司)，一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)等。

1.2方法

1.2.1大鼠分組 將60只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為梗死組和溶栓組，每組30只。建立急性腦梗死大鼠模型，溶栓組建立急性腦梗死大鼠模型后6 h經(jīng)股靜脈注入r-tPA 10 mg/kg溶栓治療，各組大鼠分別于腦梗死后1、3、7 d各取10只大鼠進行研究。

1.2.2建立腦梗死大鼠模型 取大鼠靜脈血和凝血酶混勻制作血栓，將制作的血栓剪成約1.0 mm片段，將大鼠麻醉成功后，取頸部正中切口，分離頸部動脈，結(jié)扎枕動脈、翼腭動脈、甲狀腺上動脈、頸外動脈遠心端，夾閉頸內(nèi)動脈、右側(cè)頸總動脈，在頸外動脈近心端注入12個血栓，松開右側(cè)頸總動脈夾，縫合皮膚。各大鼠清醒后，采用NSS評估神經(jīng)功能缺損情況，神經(jīng)功能評分>7分為急性腦梗死大鼠模型建立成功。60只大鼠均建模成功，無大鼠死亡。

1.2.3神經(jīng)功能評分(NSS) 分別在腦梗死后1、3、7 d，每組大鼠選10只進行神經(jīng)功能評分，分值越低表示神經(jīng)功能越好。各時間段大鼠NSS評分后處死大鼠，取腦組織進行以下研究。

1.2.4腦梗死體積測定 將腦組織切為厚5 μm切片，采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑進行染色，采用MPIAS-500多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)根據(jù)染色結(jié)果計算各組大鼠的腦梗死體積。

1.2.5微血管密度(MVD)測定 將石蠟包埋腦組織切成厚4 μm切片，經(jīng)過脫蠟水化，采用免疫組化法進行染色，以兔抗大鼠CD34為一抗，顯微鏡下觀察各組大鼠腦梗死區(qū)域MVD。

1.2.6皮層腦組織NO、MDA、NOS、SOD活性測定 分離出大鼠梗死側(cè)大腦皮層，研磨勻漿后離心取上清液，嚴格按照相應(yīng)試劑盒含量檢測試劑盒進行檢測皮層腦組織NO、MDA含量及NOS、SOD活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠腦梗死灶體積比較 腦梗死后1、3、7 d，溶栓組腦梗死灶體積均小于梗死組(P<0.05)。見表1。

2.2兩組大鼠腦梗死后NSS比較 腦梗死后1、3、7 d溶栓組NSS均低于梗死組(P<0.05)。見表2。

表1 兩組大鼠腦梗死灶體積比較

表2 兩組大鼠腦梗死后NSS比較分,n=10)

2.3兩組大鼠MVD比較 腦梗死后1、3、7 d溶栓組MVD均高于梗死組(P<0.05)。見表3和圖1。

表3 兩組大鼠MVD比較(個/視野，

圖1 免疫組化觀察MVD變化情況(×40，免疫組化)

2.4兩組大鼠皮層腦組織NO含量比較 腦梗死后1、3、7 d溶栓組大鼠皮層腦組織NO含量均低于梗死組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組大鼠皮層腦組織NO含量比較

2.5兩組大鼠皮層腦組織MDA含量比較 腦梗死后1、3、7 d溶栓組大鼠皮層腦組織MDA含量均低于梗死組(P<0.05)。見表5。

表5 兩組大鼠皮層腦組織MDA含量比較

2.6兩組大鼠皮層腦組織NOS活性比較 腦梗死后1、3、7 d溶栓組大鼠皮層腦組織NOS活性均低于梗死組(P<0.05)。見表6。

2.7兩組大鼠皮層腦組織SOD活性比較 腦梗死后1、3、7 d溶栓組大鼠皮層腦組織SOD活性均高于梗死組(P<0.05)。見表7。

表6 兩組大鼠皮層腦組織NOS活性比較

表7 兩組大鼠皮層腦組織SOD活性比較

3 討 論

腦卒中是多種原因引起的神經(jīng)功能缺損綜合征，是最常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，根據(jù)病理學(xué)分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中。缺血性腦卒中即為腦梗死，發(fā)病率、致殘率和致死率均比較高，是危害人類健康的主要疾病之一〔6〕。腦梗死是因腦組織缺血缺氧，從而引起腦壞死。腦功能缺損在腦血流完全中斷數(shù)分鐘后出現(xiàn)〔7〕。r-tPA是急性缺血性腦梗死的溶栓治療藥物，治療急性腦梗死療效顯著，在臨床被廣泛應(yīng)用〔8〕。

因急性腦梗死的治療時間窗為3 h，使多數(shù)患者失去治療的最佳時機。隨著神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死3 h后進行溶栓治療仍有一定效果〔9，10〕，Bai等〔11〕研究認為急性腦梗死的溶栓治療時間可以延長到4.5～12 h。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死后6 h進行超時間窗治療仍有一定效果，能夠降低腦梗死面積，改善神經(jīng)功能。腦梗死后微血管新生對缺血性神經(jīng)元存活發(fā)揮決定性作用，對改善急性腦梗死預(yù)后和促進學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)具有重要意義〔12，13〕。本研究結(jié)果提示6 h超時間窗溶栓治療可以提高MVD表達，因此可以認為急性超時間窗治療后大鼠腦梗死面積的減少和神經(jīng)功能的改善可能和微血管的新生范圍和新生程度有關(guān)。

氧化應(yīng)激在腦缺血和缺血再灌注損傷中是加重腦損傷的機制之一，NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與細胞保護和信息傳遞作用，但NO過多可以引起神經(jīng)元細胞的破壞，具有神經(jīng)毒性作用；NO在腦缺血損傷中的作用主要為參與氧化應(yīng)激損傷、參與炎癥反應(yīng)、損害血腦屏障、參與線粒體損傷等〔14〕。急性腦缺血可引起脂質(zhì)過氧化，MDA具有比較強的生物毒性，是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物之一，對腦組織有損傷作用。MDA具有氧化供能，可以損傷生物膜，破壞生物膜的通透性，增加膜的脆性、降低流動性；MDA還可使蛋白質(zhì)失去活性，從而對腦組織神經(jīng)元有損傷作用〔15〕。NOS可以作用于左旋精氨酸，使其合成活性很強的NO〔16〕。SOD為一種金屬鎂，在腦組織中是一種非常重要的抗氧化酶，由蛋白質(zhì)和金屬離子組成，可以消除腦細胞中過多的自由基，從而對腦組織有保護作用〔17，18〕。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6 h超時間窗溶栓治療后大鼠皮層腦組織NO和MDA含量降低，NOS活性降低，SOD活性升高?？梢?，對急性腦梗死進行超時間窗溶栓治療可以減輕腦組織的氧化應(yīng)激損傷，超時間窗治療的腦保護作用可能和其能夠降低NOS活性、減少NO合成、降低MDA含量、升高SOD活性，從而減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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