胡楊青 顏偉健 李君科 周巧玲

(邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 邵陽(yáng) 422000)

糖尿病腎病(DN)腎臟病理表現(xiàn)為有結(jié)節(jié)狀或彌漫性的系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，系膜區(qū)的增寬合并基底膜的增厚以及足細(xì)胞足突融合，終致腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化〔1〕。DN能夠引起多類(lèi)標(biāo)志蛋白如腎病蛋白(Nephrin)及超微結(jié)構(gòu)的變化，最終形成蛋白尿。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，羥基壬烯酸(4-HNE)及蛋白羰基對(duì)腎功能的氧化損傷具有一定的提示作用，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(c-Jun)在磷酸化后能夠提升轉(zhuǎn)錄活性〔2,3〕。二肽基肽酶4(DPP-Ⅳ)能夠較好地發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用，而西格列汀屬于新型的DPP-Ⅳ抑制劑。因此，分析西格列汀對(duì)DN大鼠在上述指標(biāo)方面產(chǎn)生的腎保護(hù)作用的機(jī)制，有助于臨床病情的監(jiān)測(cè)與治療。

1 材料和方法

1.1分組及模型制備 選擇邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的60只清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，平均(192.34±2.31)g。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、模型組以及干預(yù)組各20只，其中模型組和干預(yù)組均予以高脂飼料喂養(yǎng)4 w，而后在腹腔中注射產(chǎn)自武漢博士德公司的鏈脲佐菌素，劑量為30 mg/kg，再進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)4 w，用斷尾法檢測(cè)其隨機(jī)血糖，若血糖>16.7 mmol/L表明糖尿病模型已制作成功。而后每日灌胃1次，持續(xù)給藥8 w。干預(yù)組給予5 mg·kg-1·d-1的西格列汀(杭州默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20120056)灌胃，模型組及對(duì)照組給予等量的蒸餾水灌胃。在16 w末時(shí)處死大鼠，并留取24 h尿液和血清以及左腎石蠟標(biāo)本待檢。

1.2檢測(cè)方法

1.2.124 h尿微量白蛋白、尿素氮(BUN)以及肌酐(Scr)檢測(cè) 利用日立公司生產(chǎn)的7180全自動(dòng)生化分析儀及酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)24 h尿微量白蛋白、BUN、Scr水平，試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2.2免疫組化法測(cè)定大鼠DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun表達(dá) 腎組織石蠟標(biāo)本切片，厚度4 μm，撈于免疫組化片上，65℃烤片過(guò)夜，后經(jīng)二甲苯脫蠟，利用無(wú)水乙醇和梯度乙醇水化。放進(jìn)3%的過(guò)氧化氫10 min，用0.01 mol/L枸緣酸鹽的緩沖液實(shí)施高壓鍋抗原修復(fù)。之后加入一抗，37℃下孵育2 h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗聚合物，37℃孵育0.5 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，再用蘇木精復(fù)染3 min。脫水封片后，對(duì)結(jié)果實(shí)施圖像分析，在每張切片中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，檢測(cè)平均光密度值。

1.2.3PCR測(cè)定DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達(dá) Trizol提出腎臟總RNA，加入50 μl 0.1%焦碳酸二乙酯溶解之后用于反轉(zhuǎn)錄模板，合成cDNA，實(shí)施PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系：ROX 10 μl，0.5 μl 15 μmol/L的上游引物，0.5 μl 15 μmol/L的下游引物，以及2 μl的cDNA，另含7 μl的無(wú)DNAse及RNAse，總計(jì)20 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，加入活化Tag酶，94℃ 15 s及60℃ 60 s，經(jīng)45個(gè)循環(huán)后結(jié)束，計(jì)算DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達(dá)。利用Western印跡法檢測(cè)各組大鼠腎臟組織內(nèi)4-HNE及蛋白羰基的變化情況。相關(guān)試劑盒均購(gòu)于武漢博士德公司，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格根據(jù)試劑盒描述的步驟進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)及F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠生化指標(biāo)對(duì)比 模型組和干預(yù)組的體重明顯低于對(duì)照組，24 h尿微量白蛋白、BUN及Scr均明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)；干預(yù)組的體重明顯高于模型組，24 h尿微量白蛋白、BUN及Scr均分別低于模型組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠免疫組化DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun光密度值的對(duì)比 模型組和干預(yù)組DPP-Ⅳ和c-Jun光密度值均高于對(duì)照組，Nephrin光密度值低于對(duì)照組(均P<0.05)，干預(yù)組DPP-Ⅳ和c-Jun光密度值均分別明顯高于模型組，Nephrin光密度值明顯低于模型組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達(dá)情況對(duì)比 模型組和干預(yù)組DPP-Ⅳ和c-Jun mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，Nephrin mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(均P<0.05)，干預(yù)組DPP-Ⅳ和c-Jun mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組，Nephrin mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)的對(duì)比

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠免疫組化DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun光密度值的對(duì)比

表3 各組大鼠DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達(dá)情況對(duì)比

2.4各組大鼠腎臟組織內(nèi)4-HNE及蛋白羰基的表達(dá)對(duì)比 模型組和干預(yù)組腎臟組織內(nèi)4-HNE及蛋白羰基的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，且干預(yù)組腎臟組織內(nèi)4-HNE及蛋白羰基的表達(dá)明顯低于模型組(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腎臟組織內(nèi)4-HNE及蛋白羰基的表達(dá)對(duì)比

3 討 論

DN作為糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，對(duì)患者的生活質(zhì)量具有較大的影響。由于腎小球的基底膜變厚以及細(xì)胞外基質(zhì)的增多均為DN的病理性變化，并可能引起腎小球高濾過(guò)及微量蛋白尿產(chǎn)生，因此，在治療原發(fā)性糖尿病的同時(shí)，還應(yīng)監(jiān)測(cè)藥物對(duì)腎臟的影響〔4～7〕。

24 h尿微量白蛋白、BUN和Scr均為評(píng)價(jià)腎功能的常用生化指標(biāo)。本研究結(jié)果與郭靜霞等〔8，9〕的報(bào)道相符，提示患有DN的大鼠體重和腎功能均明顯下降，但經(jīng)西格列汀治療后，體重和腎功能逐漸恢復(fù)。原因可能是因?yàn)槲鞲窳型≡谥委煏r(shí)控制了糖尿病大鼠的血糖異常，在一定程度上幫助大鼠恢復(fù)了體重，并產(chǎn)生了一定的腎保護(hù)作用。DPP-Ⅳ是存在于細(xì)胞表面的一類(lèi)絲氨酸蛋白酶，可在腸內(nèi)高表達(dá)，也可通過(guò)可溶狀態(tài)存在機(jī)體的循環(huán)血液內(nèi)，對(duì)于調(diào)節(jié)血糖具有重要的作用。c-Jun屬于c-Jun氨基末端激酶(JNK)的重要下游因子，在活化條件下，c-Jun可被磷酸化，從而強(qiáng)化了轉(zhuǎn)錄活性。Nephrin是一類(lèi)特異性表達(dá)在足細(xì)胞內(nèi)的蛋白，與維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的作用密切相關(guān)。本文發(fā)現(xiàn)，經(jīng)西格列汀治療后，DN大鼠的DPP-Ⅳ和c-Jun表達(dá)明顯上升，而Nephrin表達(dá)明顯下降。分析原因，主要可能與DN大鼠機(jī)體內(nèi)的高糖環(huán)境產(chǎn)生的影響有關(guān)〔10,11〕。具體而言，高糖環(huán)境通過(guò)一系列的生化反應(yīng)變化，促進(jìn)了DPP-Ⅳ和c-Jun的表達(dá)上調(diào)，并活化了JNK的信號(hào)通路，由JNK途徑經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子以及其他的目的因子對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而誘導(dǎo)了Nephrin表達(dá)的下調(diào)，最終引起蛋白尿的產(chǎn)生〔12,13〕。4-HNE屬于脂質(zhì)損傷的重要產(chǎn)物，而蛋白羰基的水平高低能夠體現(xiàn)出蛋白氧化損傷程度，二者均可用于評(píng)估腎功能的變化。本文提示西格列汀對(duì)于DN大鼠的腎臟氧化損傷具有較好的保護(hù)作用。分析原因主要是因?yàn)槲鞲窳型∮行Ц纳屏薉N大鼠機(jī)體內(nèi)的高糖環(huán)境，進(jìn)而抑制了各類(lèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)，并通過(guò)改善蛋白尿等作用較好地發(fā)揮了腎保護(hù)作用。這在Wang等〔14〕的報(bào)道結(jié)果中也有類(lèi)似結(jié)論。

綜上所述，西格列汀對(duì)于DN大鼠具有較好的腎保護(hù)作用，其作用機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟JNK信號(hào)通路的相關(guān)活性而發(fā)揮作用。

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