史 華 何 琦 婁元俊 邵素菊

(河南省中醫(yī)院兒童腦病康復(fù)科，河南 鄭州 450002)

缺血性腦卒中通常由于腦動脈狹窄或栓塞，使得局部腦血流量突然減少或中斷，導(dǎo)致局部腦組織血氧以及能量供應(yīng)不足，引起血管內(nèi)皮繼發(fā)性損傷及自主神經(jīng)功能障礙〔1,2〕。由于成熟后的中樞神經(jīng)如遭到損傷，幾乎失去再生能力，而神經(jīng)的再生(包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化、神經(jīng)軸突分化發(fā)芽、突觸可塑性的改變)是缺血性腦卒中后神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵之一，因此，如何減少神經(jīng)再生抑制因子以及促進(jìn)神經(jīng)再生及重塑在腦缺血性腦卒中患者的治療中顯得十分重要〔3,4〕。研究者發(fā)現(xiàn)，針灸、康復(fù)訓(xùn)練、周圍環(huán)境的刺激與神經(jīng)再生密切相關(guān)，針灸治療腦缺血性腦卒中有著良好的療效，及時有效的介入治療能有效地減輕后遺癥的發(fā)生，改善腦梗死，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)，有效的康復(fù)訓(xùn)練也被廣泛應(yīng)用于改善患者腦梗死后的多種神經(jīng)及運(yùn)動功能障礙〔5～8〕。本文擬探討針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練對大腦中動脈栓塞(MCAO)大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD 大鼠，SPF 級，6月齡左右，體質(zhì)量250～280 g,由河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:SYXK(豫)2016-0009。河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供SPF級動物實(shí)驗(yàn)室。溫度20℃～26℃,濕度45%～70%，實(shí)驗(yàn)過程中所有大鼠不限飼料及水，術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.2試劑與儀器 戊巴比妥鈉，北京普博斯生物進(jìn)口分裝；powerlab電生理記錄儀，AD instruments，BX51 型 Olympus 顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3模型復(fù)制 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠仰臥于固定板上固定，去除頸部手術(shù)開口區(qū)域被毛，碘酒、酒精消毒，頸部選取正中位置進(jìn)行1～2 cm的手術(shù)開口，鈍性分離頸部皮下組織與肌肉，在左側(cè)頸內(nèi)三角處暴露頸總動脈，然后小心將頸總動脈與迷走神經(jīng)分離，鈍性分離頸內(nèi)外動脈，用電凝器將頸外動脈的分支燒斷并使其凝固，頸外動脈游離約5 mm，將頸外動脈遠(yuǎn)心端用4號手術(shù)絲線結(jié)扎，頸總和頸內(nèi)動脈用止血夾夾閉以阻止血流，于頸外動脈近心端剪一切口以便插入線栓(直徑0.26 mm)，4號手術(shù)絲線于切口處打一活結(jié)，松開夾持在頸內(nèi)動脈上的止血夾，沿頸總動脈將線栓插入頸內(nèi)動脈，使其到達(dá)大腦中動脈起始部(18～20 mm)，將頸外動脈切口處的活結(jié)扎緊，松開止血夾，逐層縫合皮膚。

1.4分組與治療 130只大鼠進(jìn)行造模，從模型復(fù)制成功的大鼠中選取80只隨機(jī)分為模型組、針刺+康復(fù)組、針刺組、康復(fù)訓(xùn)練組，每組20只；假手術(shù)組20只，除不插入線栓外，其余操作與手術(shù)組相同。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行針刺治療穴位定位及操作，選取百會、風(fēng)府。以大鼠局部輕顫為度，留針20 min。針刺第1天在模型手術(shù)術(shù)后4 h實(shí)施，置于標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)?？祻?fù)訓(xùn)練組干預(yù)方式：將大鼠置于豐富環(huán)境籠中飼養(yǎng)，籠中額外添加彩球、玩具、滾筒及積木，每天將環(huán)境設(shè)置變換1次。模型復(fù)制手術(shù)完成24 h 后開始進(jìn)行康復(fù)，康復(fù)過程中播放舒緩音樂。針刺+康復(fù)訓(xùn)練組采用的針刺方法與針刺組相同，并在此基礎(chǔ)上增加與康復(fù)訓(xùn)練組相同的康復(fù)訓(xùn)練方法。

1.5大鼠神經(jīng)行為評分 分別在治療后3、7、14 d進(jìn)行神經(jīng)行為評分。根據(jù)Berderson評分法標(biāo)準(zhǔn)：(1)提起大鼠尾巴，前肢屈曲，0分：雙前肢對稱伸向地面，1分：手術(shù)的對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈，2分：肘屈曲，3分：肩內(nèi)旋，4分：腕肘屈曲且肩內(nèi)旋。(2)大鼠置于無障礙平整地面上，推動一側(cè)肩部向?qū)?cè)移動，檢查阻力，0分：雙側(cè)阻力對等且有力，阻力下降的程度分為輕、中、重三級，計(jì)為1，2，3分。(3)雙前肢的肌張力評分，0分：大鼠雙前肢置于金屬網(wǎng)上，雙前肢肌張力對等且有力，手術(shù)對側(cè)肢張力下降程度分為輕、中、重三級，計(jì)為1，2，3分。當(dāng)發(fā)現(xiàn)大鼠向一側(cè)不停轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分。分?jǐn)?shù)高，代表大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

1.6對腦電活動的影響 于14 d治療干預(yù)1 h后檢測腦電活動。戊巴比妥麻醉，將大鼠俯臥固定，顱頂去毛，沿正中開口2 cm，暴露顱骨，于矢狀縫兩側(cè)旁開2 mm處鉆孔，將作用電極插入孔內(nèi)；參比電極插于鼻根部，用Powerlab描記腦電圖,計(jì)算腦電活動強(qiáng)弱，用平均波幅(μV)表示。

1.7TTC染色檢測大鼠腦組織梗死面積 于14 d治療干預(yù)1 h后，戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭，冰浴低溫將腦部整體取下，-20℃中放置20 min后，從額極開始每2 mm作一切片，整個腦部可以得到連續(xù)的6個切片，用1%TTC溶液在避光環(huán)境中進(jìn)行染色，37℃孵育20 min，然后用10%多聚甲醛進(jìn)行固定，24 h后將腦組織切片進(jìn)行拍照，Image J圖像分析系統(tǒng)測量照片上不著色部分面積(缺血部分不著色)，該區(qū)占整個腦組織切片面積的百分比(%)即為大鼠腦組織梗死率。

1.8對腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響 于14 d治療干預(yù)1 h后，戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取左側(cè)大腦視交叉前后2 mm冠狀切片組織塊置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，切片厚度3～4 μm，HE染色，于LEICA DMLB型光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。半定量評價腦組織損傷，鏡下將腦組織損傷程度分為0～3級(0級為0分，1級為1分，2級為2分，3級為3分)，級別越高損傷程度越嚴(yán)重。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件，計(jì)量資料組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)行為評分結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)行為評分在第3、7、14天均顯著增加(P<0.01)；第3、7天，與模型組比較，針刺組、康復(fù)訓(xùn)練組、針刺+康復(fù)組大鼠神經(jīng)行為評分顯著減少(P<0.05)；第14天，針刺組、康復(fù)組、針刺+康復(fù)組大鼠神經(jīng)行為評分顯著減少(P<0.01)。見表1。

表1 針刺+康復(fù)治療對MCAO大鼠神經(jīng)行為評分的影響

與模型組比較：1)P<0.01；2)P<0.05

2.2腦電活動檢測結(jié)果 與假手術(shù)組〔(64.56±8.03)μV〕相比，模型組大鼠腦電的平均波幅〔(29.39±3.24)μV〕顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，針刺組〔(41.11±3.15)μV〕與康復(fù)訓(xùn)練組〔(40.14±3.87)μV〕大鼠腦電的平均波幅顯著增加(P<0.05)，針刺+康復(fù)組大鼠腦電的平均波幅〔(48.36±3.10)μV〕顯著增加(P<0.01)。

2.3腦組織梗死面積檢測結(jié)果 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)%〕相比，模型組大鼠腦梗死面積比〔(27.64±2.21)%〕顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，針刺組〔(19.31±2.05)%〕與康復(fù)訓(xùn)練組〔(20.06±3.15)%〕大鼠腦梗死面積比顯著減少(P<0.05)，針刺+康復(fù)組大鼠腦梗死面積比〔(16.32±2.16)%〕顯著減少(P<0.01)。

2.4腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果 假手術(shù)組：未見腦組織異常,神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無病理改變，病變評分為0分；模型組：神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，損傷嚴(yán)重,大腦皮質(zhì)見有灶狀缺血區(qū)，淡染，組織結(jié)構(gòu)紊亂，病變評分為6.8分；針刺組：見神經(jīng)組織壞死、液化形成的圓形或卵圓形，多見核固縮及空泡樣變，病變評分為5.9分；康復(fù)訓(xùn)練組，神經(jīng)組織壞死、液化形成的圓形或卵圓形，多見核固縮及空泡樣變，病變評分為5.4分；針刺+康復(fù)組：神經(jīng)元排列致密，損傷較輕，結(jié)構(gòu)較完整，病變評分為4.8分。見圖1。

2.5腦組織病理形態(tài)學(xué)評分結(jié)果 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)分〕比較，模型組病理評分值〔(7.20±0.48)分〕顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，針刺組〔(5.42±1.02)分〕與康復(fù)訓(xùn)練組〔(5.20±1.11)分〕病理評分分值減小(P<0.05)，針刺+康復(fù)組病理評分〔(4.81±1.02)分〕顯著減少(P<0.01)。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

缺血性腦卒中早期出現(xiàn)遲緩性偏癱，隨著脊髓休克的恢復(fù)，肌張力低下的狀態(tài)得到逐漸恢復(fù)，但會伴有特殊的異常的運(yùn)動模式〔9,10〕。這種情況是由于上運(yùn)動神經(jīng)元-錐體束受損后未能恢復(fù)，而表現(xiàn)為上肢肩關(guān)節(jié)活動受限制而內(nèi)旋、前臂內(nèi)收等，而下肢表現(xiàn)如髖關(guān)節(jié)伸展以及膝關(guān)節(jié)伸展而踝關(guān)節(jié)內(nèi)翻等〔11,12〕。國內(nèi)外常用Berderson評分法對神經(jīng)行為進(jìn)行評判以評估神經(jīng)的損傷程度，分?jǐn)?shù)越高代表動物行為障礙越嚴(yán)重。腦電波是反映腦功能的客觀指標(biāo)，是大腦活動時皮質(zhì)細(xì)胞群之間電信號傳遞形成的電位差產(chǎn)生的細(xì)胞外電流〔13～15〕。缺血性腦卒中后由于局部血流量減少，病灶局部腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生病理性改變，影響突觸后電位的釋放，神經(jīng)興奮性降低，反映在腦電波活動的平均波幅呈下降趨勢。局局部缺血會引起多種能量依賴性的離子通道發(fā)生功能失調(diào)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放紊亂、蛋白合成障礙、細(xì)胞膜合成障礙、多種內(nèi)平衡被擾亂，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，神經(jīng)元壞死凋亡，引起多種神經(jīng)功能及運(yùn)動功能障礙〔16,17〕。本研究結(jié)果顯示，針刺與康復(fù)訓(xùn)練結(jié)合治療缺血性腦卒中，可有效改善腦部局部的組織損傷，增強(qiáng)神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

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