李 江 賈寶輝

(鄭州大學人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院心血管病醫(yī)院CCU,河南 鄭州 450000)

在心臟驟停(CA)過程中，血流量和氧運輸突然停止，導致全身各器官包括大腦、心臟等發(fā)生缺血性損傷。盡管心肺復蘇術(CPR)的應用已經普及，但是血流量減少以及組織氧不足都會損傷心肌功能，導致血流動力學的不穩(wěn)定以及微血管功能障礙。為了減輕缺血缺氧對機體的損傷，調節(jié)大腦的神經機制會通過改善血腦屏障的通透性，減少腦水腫的形成等促進腦損傷的恢復〔1，2〕。 CPR后的心肌損傷常導致患者發(fā)生嚴重的心功能障礙而死亡〔3〕。烏司他丁(UTI)又稱為尿胰蛋白酶抑制劑，可以改善CPR患者的心功能，并對心臟有一定的保護作用〔4，5〕。促炎細胞因子如白細胞介素(IL)、淋巴因子和細胞信號分子，在某些疾病中調節(jié)細胞的反應，誘導細胞到炎癥部位并調節(jié)細胞的生存分裂以及增殖分化〔6〕。IL-1β作為免疫和炎癥反應介質，在腦缺血缺氧中發(fā)揮重要作用〔7〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種促炎癥因子，在體內多種重要過程中發(fā)揮關鍵作用，包括炎癥、自身免疫、細胞生長、增殖分化和凋亡等〔8，9〕。本研究旨在探討UTI對CPR后大鼠心功能及腦組織細胞因子的干預作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(常州卡文斯實驗動物中心，生產許可證號：SCXK (蘇) 2011-0003)30只，雌雄各半，體重350～450 g，平均(400.1±11.2)g。隨機分為空白對照組、CPR組和UTI組，每組10只。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF環(huán)境，溫度(20.2±3.1)℃，相對濕度60%～80%，通風良好，光暗周期12 h∶12 h，飼養(yǎng)1 w適應本實驗中心環(huán)境，自由活動。術前12 h禁食。

1.2研究方法

1.2.1動物處理 空白對照組(不進行窒息及CPR，只進行麻醉和氣管切開插管、血管穿刺)；CPR組(靜脈注射生理鹽水4 ml/kg，CA后4 min給藥)；UTI組(UTI 50 000 U/kg+生理鹽水3 ml/kg，50 000 U配制成1 ml，CA后4 min給藥)，UTI注射液購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。除空白對照組外，CPR組和UTI組均根據(jù)相關的文獻〔10〕利用夾閉氣管窒息法建立大鼠CA模型。術中同步監(jiān)測左室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)水平及左心室壓力上升(+dp/dtmax)、下降最大速率(-dp/dtmax)。CPR組大鼠體重(390.8±23.1)g，窒息導致CA時間(413.1±26.2)s，CPR持續(xù)時間(631.3±125.1)s；UTI組大鼠體重(395.0±16.4)g，窒息導致CA時間(406.9±23.1)s，CPR持續(xù)時間(627.4±79.3)s，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2.2電鏡觀察 實驗中從每組隨機選出2只大鼠，自主循環(huán)恢復(ROSC)后2 h應用生理鹽水灌注大鼠心臟至血液成為干凈的鹽水為止。對大鼠施行開胸術取出左心室壁的心肌組織，制作成0.01 cm2的組織塊，經過①2%多聚甲醛-2.5%戊二醛電鏡專用液固定(4℃，2 h)；②二甲砷酸鈉緩沖液沖洗(3次，每次10 min)；③1%鋨酸固定(4℃，2 h)；④梯度酒精脫水；⑤環(huán)氧丙烷置換(2次，每次15 min)；⑥環(huán)氧樹脂Epon812 包埋劑包埋；⑦超薄切片；⑧醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛染色。最后采用Philip EM 208s 透射電鏡觀察大鼠心肌細胞。

1.2.3觀察指標 ROSC后0 h及6 h均記錄LVSP、LVEDP、±dp/dtmax。CPR后24 h處死大鼠，取出大腦心腦組織標本，-80℃冷凍保存。每組取部分心組織進行固定，并采用投射電鏡觀察心肌細胞超微結構。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測各組腦組織中IL-1β、TNF-α的含量，ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0軟件，計量資料兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1心功能變化 ROSC 0 h三組LVSP、LVEDP及±dp/dtmax比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與ROSC 后0 h比較，ROSC后6 h空白對照組各指標無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ROSC后6 h CPR組、UTI組LVSP及±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)。與空白對照組相比，ROSC后6 h CPR組、UTI組LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均顯著下降(P<0.05)，而LVEDP顯著上升(P<0.05)；與CPR組相比，ROSC后 6 h UTI組LVSP上升，LVEDP下降(P<0.05)。見表1。

2.2電鏡結果 空白對照組心肌纖維大小均勻，排列規(guī)則，心肌細胞正常，胞核大小及形態(tài)均正常，線粒體形態(tài)正常，嵴排列整齊；CPR組心肌纖維排列紊亂，有心肌細胞的線粒體外膜不完整現(xiàn)象存在，并且有線粒體增生情況出現(xiàn)，嵴變得模糊不易分辨，除此之外，還出現(xiàn)了空泡樣變的線粒體，細胞核大小及形態(tài)不均勻；UTI組心肌纖維排列尚整齊，胞核大小及形態(tài)均勻，線粒體增生明顯但是嵴結構正常，另外心肌間質內出現(xiàn)少量的炎性細胞浸潤。

2.3腦組織IL-1β、TNF-α檢測結果 三組大鼠腦組織標本中IL-1β、TNF-α含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中CPR組、UTI組IL-1β、TNF-α含量均顯著高于空白對照組(P<0.05)，UTI組IL-1β、TNF-α含量均顯著低于CPR組(P<0.05)。見表2。

表1 ROSC 6 h后三組大鼠心功能的變化

與空白對照組比較：1)P<0.05；與ROSC后0 h比較：2)P<0.05；與CPR組比較：3)P<0.05

表2 各組腦組織中IL-1β、TNF-α含量比較

與空白對照組相比:1)P<0.05 ；與CPR組相比:2)P<0.05

3 討 論

CPR是搶救CA患者必不可少的一個過程，但是隨之而來的還有復蘇后的再灌注損傷，其中心臟的功能障礙最常出現(xiàn)。主要原因是心跳和呼吸的突然停止，導致心臟缺血缺氧，引發(fā)心肌組織損傷，而應用CPR使CA患者自主循環(huán)呼吸恢復后，心肌細胞重新恢復供血和供氧而遭受再灌注的損傷，使心功能發(fā)生障礙，嚴重的會出現(xiàn)心功能衰竭，甚至出現(xiàn)猝死。炎性細胞因子的“瀑布”樣連鎖反應促進了多功能障礙的發(fā)生，其中TNF-α是主要的炎性因子，在炎癥反應中起到了核心作用〔11〕；它是激活細胞因子“瀑布”樣反應的促進因子，同時也是機體維持穩(wěn)態(tài)/抵御各種致病因子不可缺少的免疫調節(jié)因子〔12〕。TNF-α含量的高低與疾病的嚴重程度呈正相關，而且可以誘發(fā)機體的代謝和血流動力學發(fā)生明顯的變化，同時TNF-α可以誘導IL-1β以及繼發(fā)性介質的產生，更加促進炎癥的連鎖反應，導致炎性因子“瀑布效應”〔13〕。有研究發(fā)現(xiàn)，CPR后大鼠體內的TNF-α與IL-1β表達均明顯升高，并且TNF-α和IL-1β的表達呈正相關的關系〔14〕。腦組織發(fā)生缺血缺氧后，活化的星形細胞、少突膠質細胞以及浸潤的單核巨噬細胞分泌IL-1β，IL-1β通過介導小膠質細胞釋放細胞因子，促進內皮細胞表達黏附分子，因而刺激單核巨噬細胞產生TNF-α，加重局部的炎癥反應。同時IL-1β可以促進白細胞在炎癥部位的聚集，同時激活中性粒細胞參與炎癥的發(fā)展，通過破壞血腦屏障而加重腦水腫的發(fā)生〔15〕。

本實驗提示經過CPR后的CA大鼠已經出現(xiàn)了心臟的收縮和舒張功能不全。應用UTI以后，大鼠的LVSP較CPR組有明顯升高，LVEDP明顯降低，說明應用UTI后可以改善心肌的舒縮功能。除此之外，心肌細胞的電鏡觀察結果顯示，CPR組大鼠的心肌細胞出現(xiàn)了結構損傷，而正常心功能的基礎就是心肌細胞結構的完整，說明大鼠經過CPR后心肌細胞出現(xiàn)了嚴重的損傷，導致了心功能的降低。UTI可以抑制纖溶酶、粒細胞彈性蛋白酶以及絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、α-糜蛋白酶)等多種酶發(fā)生反應〔16〕。通過UTI與絲氨酸蛋白酶相結合而阻滯這些毒性蛋白酶發(fā)生催化反應，從而起到了保護機體組織細胞的作用〔17〕。之前的研究發(fā)現(xiàn)，UTI可以抑制過度的炎癥反應，對單核細胞釋放TNF-α具有明顯的抑制作用〔18〕。UTI在中樞系統(tǒng)的保護作用已有研究證實〔19〕。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)〔20〕UTI可以抑制氧自由基生成，同時抑制多種炎癥介質如TNF-α、血小板活化因子(PAF)以及IL-6、IL-8等的產生。因此推測UTI的保護作用與其抗炎作用有密切關系。本實驗也發(fā)現(xiàn)使用UTI可以明顯減少PRC大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的表達，推測UTI在CPR大鼠中通過減輕炎癥反應降低腦組織的損傷。有報道稱UTI在CA導致的腦缺血缺氧中，通過減輕腦水腫以及炎癥反應而起到保護腦組織的作用〔21〕。然而，本研究仍然存在局限性。CA引起的心臟缺血缺氧與多種炎癥介質的釋放有關，而此次只討論了TNF-α和IL-1β的變化，抑制TNF-α和IL-1β可能是UTI保護作用的一部分，UTI確切機制還需要進一步研究。

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