倪 釗 王勤章 李應(yīng)龍 李 強 錢 彪 王新敏 歐陽松 李 晨 董洪超 高存祥 劉志立

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子 832008)

順鉑(CDDP)為膀胱癌化療方案中的“骨架”藥物，隨著近年來腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥性逐漸增強，膀胱癌患者接受含CDDP化療方案的完全緩解率明顯降低〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，化療過程中腫瘤細(xì)胞耐藥抵抗與CDDP對表皮生長因子受體(EGFR)信號通路的激活有關(guān)〔2〕。動物實驗顯示，LRIG3基因可負(fù)性調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)EGFR通路，發(fā)揮抑癌作用〔3〕。基于上述研究，本次研究將LRIG3基因轉(zhuǎn)入人膀胱癌耐藥細(xì)胞株BIU-87使其過表達(dá)，以CDDP為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素，觀察BIU-87細(xì)胞對CDDP敏感性變化并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人膀胱癌耐藥細(xì)胞株BIU-87購于上海研域生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；CDDP購于(費森尤斯卡比武漢)醫(yī)藥有限公司)；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒購于廣州健侖生物科技有限公司；EGFR兔抗人多克隆抗體、LRIG3兔抗人多克隆抗體和相應(yīng)的二抗購于上海信裕生物科技有限公司；委托上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建SP-EGFR重組腺病毒載體(含Survivn啟動子但不含LRIG3基因)，同時構(gòu)建SL-EGFR重組腺病毒載體(含Survivn啟動子和LRIG3基因)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中單層生長，每2天換液1次，取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗。實驗分為觀察組(轉(zhuǎn)染SL-EGFR重組腺病毒載體)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染SP-EGFR重組腺病毒載體)，空白對照組。按5×106/孔的密度將BIU-87細(xì)胞接種到6孔板，常規(guī)培養(yǎng)過夜，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞比例計算感染率。感染率≥60%后按組別分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)的腺病毒載體，感染72 h后收集感染成功率≥60%的細(xì)胞提取RNA和蛋白進(jìn)行檢測。CDDP誘導(dǎo)凋亡實驗分組：將上述3組細(xì)胞給予CODP干預(yù)后，分為CDDP組、CDDP/SP-EGFR組、CDDP/ SL-EGFR組，新增未給予CODP干預(yù)的空白組。

1.3RT-PCR檢測LRIG3和EGFR mRNA表達(dá)情況 Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法定量濃度和純度，取2.0 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94℃5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下拍照，以GAPDH為內(nèi)參計算LRIG3、EGFR mRNA相對表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測LRIG3和EGFR蛋白表達(dá)情況 蛋白質(zhì)提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)及核蛋白質(zhì)，4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清，-80℃凍存待測。8% SDS-PAGE凝膠上電泳，上樣量20 μg，濕法轉(zhuǎn)膜到PVDF，10%脫脂奶粉室溫下2 h，滴加兔抗人LRIG3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人EGFR及p-EGFR多克隆抗體(1∶2 000)，以兔源性β-actin多克隆抗體(1∶1 000)為內(nèi)參，室溫下反應(yīng)2 h；洗膜后滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫下反應(yīng)2 h。ECL顯色后用凝膠成像系統(tǒng)讀取各條帶灰度值。

1.5CCK-8法檢測細(xì)胞抑制率 將CDDP組、CDDP/ SP-EGFR組、CDDP/ SL-EGFR組細(xì)胞按1×107/孔的密度接種到96孔板中，每孔150 μl，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，滴加濃度為0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml的CDDP，每孔150 μl，設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。每孔滴加20 μl CCK-8，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度值，計算細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)期BIU-87細(xì)胞，按1×107/孔的密度接種到6孔板中，觀察貼壁后按分組加入相應(yīng)濃度的藥物，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取上層懸浮細(xì)胞，4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液沖洗，用稀釋的結(jié)合緩沖液配成濃度為1×105/孔的單細(xì)胞懸液，取6 ml放入流式管中，向每個試管中分別滴加FITC、5 mg/L的碘化丙啶10 μl，室溫下避光放置20 min，上流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1重組腺病毒感染BIU-87細(xì)胞情況 當(dāng)感染復(fù)數(shù)達(dá)到25時，熒光顯微鏡視野下觀察組、陰性對照組的BIU-87細(xì)胞感染率均≥60%，空白對照組無綠色熒光蛋白表達(dá)。見圖1。

2.2LRIG3和EGFR mRNA在BIU-87細(xì)胞中的表達(dá) 觀察組LRIG3 mRNA相對表達(dá)量為2.80±0.26，明顯高于陰性對照組的0.85±0.07和空白對照組的0.73±0.05(P<0.01)；觀察組EGFR mRNA相對表達(dá)量為0.54±0.06，明顯高于陰性對照組的1.87±0.13和空白對照組的2.12±0.06(P<0.01)；陰性對照組與空白對照組LRIG3、EGFR mRNA表達(dá)量之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.3LRIG3和EGFR 蛋白在BIU-87細(xì)胞中的表達(dá) 觀察組LRIG3 蛋白的相對表達(dá)量為1.87±0.23，明顯高于陰性對照組的0.94±0.15和空白對照組的1.10±0.18(P<0.01)；觀察組EGFR 蛋白的相對表達(dá)量為0.83±0.07，明顯高于陰性對照組的2.62±0.08和空白對照組的2.53±0.15(P<0.01)；陰性對照組與空白對照組LRIG3、EGFR 蛋白表達(dá)量之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖1 熒光顯微鏡觀察BIU-87細(xì)胞感染情況(×40)

1～3分別為觀察組、陰性對照組、空白對照組LRIG3，大小為883 bp；4～6分別為觀察組、陰性對照組、空白對照組EGFR，大小為469 bp；M：Marker圖2 各組BIU-87細(xì)胞中LRIG3和EGFR mRNA表達(dá)

圖3 各組BIU-87細(xì)胞中LRIG3和EGFR 蛋白表達(dá)

2.4不同濃度CDDP對各組細(xì)胞生長抑制情況及IC50值 CDDP處理24 h后3組細(xì)胞生長抑制率均隨CDDP濃度增加而升高(見表1)。CDDP/SL-EGFR組細(xì)胞IC50值為(14.53±0.42)μg/ml，明顯低于CDDP/SP-EGFR組的(31.44±0.59)μg/ml和CDDP組的(30.85±0.67)μg/ml(P<0.01)；CDDP/SP-EGFR組與CDDP組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，后續(xù)實驗中CDDP的干預(yù)濃度定為30 μg/ml。

表1 不同濃度CDDP對各組細(xì)胞抑制率

同組內(nèi)不同濃度間比較：1)P<0.05

2.5CDDP對各組細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，CDDP/SL-EGFR組細(xì)胞凋亡率(70.88±3.25)%，明顯高于CDDP/SP-EGFR組的(49.26±2.64)%、CDDP組的(47.93±2.31)%和空白對照組的(3.28±0.38)%(P<0.01)。

2.6LRIG3和CDDP對BIU-87細(xì)胞EGFR表達(dá)的影響 30 μg/ml CDDP作用24 h后，空白對照組、CDDP組、CDDP/SP-EGFR組、CDDP/SL-EGFR組的BIU-87細(xì)胞總EGFR蛋白相對表達(dá)量分別為2.63±0.22、1.33±0.06、1.36±0.06、0.43±0.03；p-EGFR蛋白相對表達(dá)量分別為1.87±0.13、2.86±0.26、2.93±0.26、1.19±0.05。CDDP組總EGFR蛋白相對表達(dá)量明顯低于空白對照組，而p-EGFR蛋白相對表達(dá)量明顯高于空白對照組(P<0.01)。CDDP組與CDDP/SP-EGFR組EGFR蛋白和p-EGFR蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CDDP/ SL-EGFR組EGFR蛋白和p-EGFR蛋白相對表達(dá)量明顯低于CDDP/SP-EGFR組(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組BIU-87細(xì)胞中EGFR和p-EGFR蛋白表達(dá)

3 討 論

含CDDP的化療方案對膀胱癌敏感性較佳，總有效率可達(dá)50%～70%，但近年來隨著化療過程中腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)的獲得性耐藥，僅10%～20%膀胱癌患者化療后癥狀完全緩解〔4〕。相關(guān)研究顯示，細(xì)胞DNA受損后修復(fù)能力提升是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對CDDP耐藥的主要原因〔5〕。當(dāng)處于低氧、紫外線、強氧化物等多種環(huán)境下時均可導(dǎo)致DNA損傷，促進(jìn)EGFR進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，上調(diào)DNA激酶活性，代謝為有活性的p-EGFR，修復(fù)DNA損傷〔6〕。本次研究中未給予CDDP干預(yù)的空白對照組細(xì)胞核中p-EGFR低表達(dá)，而給予CDDP誘導(dǎo)DNA損傷后細(xì)胞核中p-EGFR表達(dá)水平明顯提升，提示CDDP化療引發(fā)的BIU-87細(xì)胞DNA損傷介導(dǎo)的EGFR進(jìn)入細(xì)胞核，是引發(fā)敏感性降低的原因之一。

LRIGs基因廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)成員包括LRIG1～3，其均可編碼結(jié)構(gòu)相似的跨膜糖蛋白，在細(xì)胞外存在多個Ig樣結(jié)構(gòu)域和亮氨酸序列〔7〕?；A(chǔ)研究顯示，人類與鼠LRIGs基因與蛋白存在高度的同源性〔8〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)，LRIG3可在胞外與EGFR直接結(jié)合，抑制EGF與其結(jié)合，還可提升EGFR對C-cbl的募集與結(jié)合，加速EGFR的降解和泛素化，發(fā)揮抑制信號傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用〔9〕。本次研究進(jìn)一步探討LRIG3對人膀胱癌BIU-87細(xì)胞CDDP敏感性的影響機制，結(jié)果顯示，LRIG3和EGFR 蛋白均表達(dá)與BIU-87細(xì)胞中，在CDDP誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染含Survivn啟動子和LRIG3基因的CDDP/SL-EGFR組細(xì)胞凋亡率明顯提升，p-EGFR表達(dá)水平明顯降低；且轉(zhuǎn)染LRIG3基因后，CDDP對BIU-87細(xì)胞的IC50值明顯降低。提示LRIG3基因過表達(dá)可通過結(jié)合并下調(diào)p-EGFR水平，阻斷CDDP對EGFR通路的激活作用，提升膀胱癌耐藥細(xì)胞株BIU-87對CDDP的敏感性。

1王 征，耿進(jìn)成，馮連成，等.吡柔比星與順鉑同步化療聯(lián)合放療治療老年膀胱癌對患者生存質(zhì)量的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(4)：787-8.

2Senfter D，Huttary N，Krupitza G,etal.Drug resistance mediated changes in lymphendothelial tumor cell intravasation〔J〕.Int J Clin Pharmacol Ther，2014；52(1)：82-4.

3Easwaran H，Tsai HC，Baylin SB，etal.Cancer epigenetics：tumor heterogeneity，plasticity of stem-like states，and drug resistance〔J〕.Mol Cell，2014；54(5)：716-27.

4陳三三.沉默Cdc6逆轉(zhuǎn)膀胱癌順鉑耐藥的實驗研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2016.

5李 誠，蘭 莉，楊 超，等.哈爾濱市癌癥風(fēng)險評估系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用〔J〕.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2016；15(4)：388-9.

6李 倩，蘇 宇，陳亞娟，等.姜黃素對人膀胱癌細(xì)胞系T24體外侵襲的作用〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015；16(2)：203-5.

7關(guān)云哲，楊東彪，王振中，等.表淺性膀胱癌細(xì)胞中DNA核酸內(nèi)切酶ERCC1及膜連蛋白-1的表達(dá)及與順鉑耐藥的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(10)：2315-7.

8蘇 宇，李 倩，武建輝，等.姜黃素聯(lián)合阿霉素對膀胱癌 T24生長抑制的協(xié)同作用〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2013；14(4)：423-5.

9黃智龍.CYLD通過調(diào)節(jié)自噬逆轉(zhuǎn)膀胱癌化療耐藥性的機制研究〔D〕.濟南：山東大學(xué)，2016.