馬華怡 李遠眺 韋怡怡 劉 歡 戴 敏

(柳州市工人醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西 柳州 545001)

隱球菌感染途徑主要通過吸入孢子或者感染性的芽體〔1，2〕。輔助性T細胞(Th)包括Th1、Th2、Th17、調節(jié)性T細胞(Treg)，在真菌感染中發(fā)揮著重要的作用。Th1細胞免疫反應可以有效地控制隱球菌〔3，4〕。相反，缺失Th2細胞特異的細胞因子，如白細胞介素(IL)-4、IL-13可以對隱球菌的感染起到保護作用并且可以促進其存活〔5～8〕。目前對于Th17在隱球菌感染中的作用尚不清楚。對隱球菌感染進程中Th細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Th1與Th2細胞產(chǎn)生的免疫反應可以同時被誘導〔9～11〕。在用隱球菌感染小鼠后，盡管有利的Th1免疫反應還存在，但有害的Th2免疫反應也會增加并且導致小鼠死亡。另外一種輔助性T細胞即表達Foxp3的Treg細胞被發(fā)現(xiàn)，在急性與慢性的感染中都可以限制病原特異性的T細胞產(chǎn)生的免疫反應〔12～17〕。目前CD4+FoxP3+Treg細胞在隱球菌的感染中作用研究還較少，而且對于它是否會對在感染中被誘導出來的Th亞群有作用也未知。本文擬分析Treg在隱球菌感染中的作用及其是否會對其他3種Th亞群的免疫功能產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1材料 感染隱球菌8～12 w的雌鼠，品系為BALB/c，養(yǎng)在特定的無病原體的動物房中。CD4+FoxP3+Treg細胞的DEREG鼠為BALB/c背景〔18〕。使用500 CFU的隱球菌184通過鼻內感染小鼠〔11〕。DEREG鼠通過腹腔注射100 μl濃度為1 μg/100 μl的DT(Calbiochem,Merck,Germany),從而誘導Treg細胞的敲除。分別在感染隱球菌后的第7、9、11、13天注射。對照組WT注射等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2肺部隱球菌計數(shù)與淋巴細胞提取 無菌中操作，將老鼠肺部細胞用濃度為50 μg/ml的DNA酶4與1 mg/ml的膠原酶D在RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃旋轉消化30 min。采用100 μm細胞過濾器制備單細胞懸液。

1.2.1肺部細胞中隱球菌數(shù)目的計數(shù) 采用梯度稀釋，分別稀釋10、102、103、104、105倍，將肺部組織勻漿在沙氏葡萄糖瓊脂板中30℃培養(yǎng)72 h，對隱球菌數(shù)目進行計數(shù)。

1.2.2淋巴細胞提取 采用percoll密度梯度離心分離淋巴細胞，采用1×106個/ml的密度對淋巴細胞用PMA與離子霉素刺激，分析細胞因子分泌。

1.3流式細胞術分析樣品的制備

1.3.1將分離得到的細胞置于1 ml T細胞培養(yǎng)基中，加入25 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素，37°細胞培養(yǎng)箱中刺激0.5 h后加入 brefeldin A，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。收樣，標記抗體。

1.3.2流式抗體標記 先標記表面抗體，然后固定后，再破膜標記細胞因子與轉錄因子。(1)表面抗體標記：將細胞重懸在150 μl PBS中，按照1×106細胞標1 μl流式抗體。置于4℃冰箱中避光孵育30 min，用1 ml PBS洗1～2次。(2)細胞質中細胞因子與細胞核內轉錄因子的標記，使用ebioscience公司胞質與核固定液，按照說明書進行固定與標記。

1.4儀器與試劑 T細胞培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基，10%FBS(Gibco 900-108)，青霉素/鏈霉素溶液(Gibco 15140-122)，2-巰基乙醇(Invitrogen 21985-023)。流式儀器：calibure 流式熒光抗體，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒均購自eBioscience公司。

1.5統(tǒng)計學分析 應用SPSS20.0軟件進行Mann-WhitneyU檢驗。

2 結 果

2.1感染隱球菌后Treg細胞的變化 感染了隱球菌后肺部CD4+FoxP3+Treg細胞顯著增多。采用流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，在用隱球菌處理后的前4 w，肺部Treg細胞的比例與數(shù)目持續(xù)升高(P<0.05)。見表1。

2.2Treg細胞缺失后肺部隱球菌量與存活率變化 缺失CD4+FoxP3+Treg細胞后，抗隱球菌能力與存活率降低。在感染了隱球菌7 d后在腹腔中注射白喉毒素，將Treg細胞敲除。結果發(fā)現(xiàn)，感染28 d后，Treg細胞被敲除的小鼠，其肺部真菌含量明顯高于未敲除的小鼠近3倍，同時其存活時間明顯降低，在42 d時后基本死亡。見表2，表3。

表1 感染隱球菌后Treg細胞的變化

與0 d組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表2 Treg細胞缺失后肺部中隱球菌量變化增加倍數(shù))

與野生型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表3 Treg細胞缺失后鼠存活率變化

2.3CD4+FoxP3+Treg細胞缺失對Th1、Th17細胞亞群的影響 敲除Treg細胞后，感染28 d的小鼠肺部淋巴細胞里，Th1特異的細胞因子干擾素(IFN)γ，Th17特異的細胞因子IL-17的表達均沒有顯著變化。而Th2特異性的細胞因子IL-4表達都有顯著升高(P<0.01)。見表4。

表4 Treg細胞缺失后Th1、Th17、Th2細胞亞群變化

2.4CD4+FoxP3+Treg細胞缺失后，Th2細胞特異性轉錄因子與細胞因子的變化 GATA3的表達在Treg細胞敲除的鼠中表達顯著性升高；而且，IL-5，IL-13的表達也顯著性升高(P<0.05)；與Th2相關的血清中IgE表達也顯著性升高，見表5。

表5 Treg細胞缺失后，th2細胞亞群特異轉錄因子及其相關細胞因子的變化

3 討 論

真菌感染對于免疫系統(tǒng)受損的患者來說將會導致危及生命的疾病〔19〕。由于在發(fā)展中國家艾滋病的傳播，以及在西方國家中因為器官移植和癌癥治療等所引起的免疫抑制治療等，免疫系統(tǒng)受損的人群已經(jīng)越來越多，由此導致的侵襲性真菌感染，比如念珠菌病、隱球菌病、曲霉病等越來越普遍〔20〕。盡管已經(jīng)有各種抗真菌的藥物，然而由于新的耐藥性真菌的出現(xiàn)，以及這些抗真菌藥物本身的副作用，使得探究新的抗真菌藥物顯得尤為重要〔21〕。已有報道顯示，Th1相關的免疫應答對于真菌感染具有保護性，而Th2相關的免疫能力具有有害性〔22,23〕。Treg細胞可以限制過強的免疫反應、免疫炎癥，同時它也會阻礙有效的保護性的免疫反應，從而導致了真菌的免疫逃逸〔24,25〕。在用卡氏肺孢子蟲感染小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，Treg細胞可以預防由清除病原體所導致的過度組織損傷〔26〕。而與之相反，在消化道念珠病動物模型中，Treg細胞所產(chǎn)生的IL-10及TGF-β可以抑制機體對念珠菌的清除，而在肺部曲霉病的動物模型中發(fā)現(xiàn)，Treg細胞可以預防過敏反應〔27,28〕?？偠灾?，Treg細胞隨著感染位置與真菌種類的不同而發(fā)揮著不同的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染了隱球菌的前4 w，肺部CD4+FoxP3+Treg細胞顯著增加,這種增加可能跟Treg細胞增殖能力變強或者招募的treg細胞增多有關。為了探究Treg細胞在肺部隱球菌感染的作用，我們使用了Treg細胞敲除的基因敲除DEREG鼠。在Treg細胞缺失后，肺部中的隱球菌量明顯增多，Th2細胞相關的細胞因子IL-4、IL-5、IL-13在肺部中都有明顯的增加，同時血清中IgE的水平也顯著升高。有報道顯示，在人和鼠，Treg細胞的受損會增加血清中的IgE表達〔29,30〕。

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