蔣征奎 李 曉 陳 卓

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

阿爾茨海默病(AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，近年來(lái)，研究者對(duì)老年癡呆的病因及發(fā)病機(jī)制從不同角度提出了各種假說(shuō)〔1〕，但因該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。臨床上尚無(wú)特效治療藥物，目前所用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑、膽堿酯酶抑制劑、鈣通道拮抗劑等，雖在一定程度上可以改善患者的癥狀，但不能治本，加上一些副作用，越來(lái)越多的研究者青睞中醫(yī)藥的研究。石菖蒲Acorustatarinowii Schott為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，其單方和復(fù)方在臨床上常用于治療老年期癡呆，前期研究表明，揮發(fā)油作為石菖蒲的主要有效成分，可通過(guò)降低一氧化氮(NO)神經(jīng)細(xì)胞毒性保護(hù)腦細(xì)胞〔2〕。本文觀察石菖蒲揮發(fā)油改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1石菖蒲藥材 購(gòu)自鄭州張仲景大藥房，經(jīng)河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙天增研究員鑒定為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根莖。

1.2揮發(fā)油制備 按中國(guó)藥典〔2〕中揮發(fā)油提取方法，提取揮發(fā)油，共得揮發(fā)油10 g。

1.3動(dòng)物、藥品與試劑 Wistar大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，體重250～300 g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；腦復(fù)康片(0.4 g/片，天津金世藥業(yè)，批號(hào)20130110)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)；大鼠腦立體定位儀(深圳，瑞沃德生命科技有限公司)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生藥工程研究所)，紫外分光光度計(jì)(上海，奧析科學(xué)儀器)，分析天平(瑞士，梅特勒托利多)。

1.4動(dòng)物分組與模型制備〔3，4〕

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的初篩 采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選學(xué)習(xí)記憶功能正常的大鼠，具體為：大鼠飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境后，從距離平臺(tái)象限最遠(yuǎn)的象限將大鼠面向池壁放入水池，以到達(dá)平臺(tái)時(shí)間40～120 s的大鼠為記憶功能正常大鼠。

1.4.2動(dòng)物分組與給藥 取初篩合格的大鼠56只，隨機(jī)分為7組，分別為空白組、假手術(shù)組、模型組、腦復(fù)康組、石菖蒲揮發(fā)油高、中、低劑量組，其中空白組、假手術(shù)組、模型組按5 ml/kg給予溶媒(2%丙二醇+2%聚乙二醇硬脂酸酯15)，腦復(fù)康組將腦復(fù)康加溶媒配置為混懸液按0.3 g/kg(相當(dāng)于臨床用藥的10倍)灌胃給藥，石菖蒲揮發(fā)油組高、中、低劑量組分別為5、10、20 mg/kg，從第1天造模開(kāi)始，連續(xù)灌胃給藥20 d，實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物自由攝食和飲水，術(shù)前禁食。

1.4.3STZ側(cè)腦室注射動(dòng)物模型的制備 大鼠以3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，頭固定于腦立體定位儀上，參考《大鼠腦立體定向圖譜Ⅲ》，沿矢狀線切開(kāi)皮膚約1.5 cm，推開(kāi)兩側(cè)骨膜暴露顱骨，微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)入距離腦表面3.6 mm，STZ以人工腦脊液配置成100 mg/ml，緩慢注入大鼠兩側(cè)側(cè)腦室，注入時(shí)間2 min，留針3 min，緩慢出針，無(wú)菌骨蠟封閉鉆孔，縫合消毒防止感染。其中，手術(shù)第1天和第3天分別向模型組、腦復(fù)康組和石菖蒲揮發(fā)油高、中、低劑量組大鼠兩側(cè)腦室每次每側(cè)注入10 μl配置好的STZ，假手術(shù)組大鼠給予同體積人工腦脊液，正常飼喂14 d后試驗(yàn)。

1.5學(xué)習(xí)記憶功能實(shí)驗(yàn)

1.5.1水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮水池直徑160 cm，高50 cm，水深29 cm；平臺(tái)直徑12 cm，高27 cm，固定于目標(biāo)象限(SE象限)水面下2 cm處。攝像鏡頭安放于水池中心上方距離水池底部2 m處，用以同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，水溫保持(22±1)℃。將動(dòng)物面朝池壁標(biāo)示輕輕放入水中，分別從4個(gè)象限的入水點(diǎn)入水，記錄動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，然后讓動(dòng)物在平臺(tái)上停留20 s。如果120 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則實(shí)驗(yàn)自動(dòng)停止，潛伏期計(jì)為120 s，并將動(dòng)物引導(dǎo)置于平臺(tái)上停留20 s。訓(xùn)練結(jié)束后，將大鼠放回飼養(yǎng)籠中。每天分上午和下午兩個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練 4 次，每次至少間隔30 min，訓(xùn)練共需要5 d，記錄8次潛伏期時(shí)間，以均值作為該天成績(jī)。

1.5.2跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，即實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第21天，撤除平臺(tái)，然后將大鼠從平臺(tái)的對(duì)面入水點(diǎn)入水，記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳路徑，對(duì)大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)及在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀察受試動(dòng)物的空間定位能力及在空間探索過(guò)程中的變化規(guī)律。

1.6SOD和MDA的含量測(cè)定 學(xué)習(xí)記憶功能實(shí)驗(yàn)后，將動(dòng)物脫臼處死，剝?nèi)∧X組織，在生理鹽水水浴中去除小腦，濾紙拭干，稱重。在生理鹽水冰浴中制成10%腦組織勻漿，用玻璃勻漿器以3 000 r/min離心10 min，分離后取其上清液，分為兩份，分別按照試劑盒說(shuō)明處理，測(cè)定各組大鼠腦組織勻漿SOD和MDA含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.1.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組找到平臺(tái)時(shí)間隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而減少，定位航行試驗(yàn)第3天模型組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組比較明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，顯示實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹谱魇浅晒Φ?，在?天、第5天石菖蒲揮發(fā)油高、中劑量組與模型組有顯著差異，其中石菖蒲高劑量組藥效與腦復(fù)康組相當(dāng)，石菖蒲揮發(fā)油低劑量組也顯現(xiàn)出一定的藥效，但與模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較

與模型組比較：1)P<0.01，下表同

2.1.2跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組在每個(gè)象限的停留時(shí)間均較長(zhǎng)，并且出現(xiàn)圍繞池壁繞圈的現(xiàn)象，而各治療組此現(xiàn)象均有不用程度的改善。與模型組比較，各治療組中大鼠跨越平臺(tái)的次數(shù)、在平臺(tái)象限停留的時(shí)間及在有效區(qū)停留的時(shí)間均有不同程度增加，石菖蒲揮發(fā)油高、中劑量組與模型組有顯著差異(P<0.01)，石菖蒲揮發(fā)油高劑量藥效與腦復(fù)康組相當(dāng)(P>0.05)，石菖蒲低劑量組也顯現(xiàn)出一定的藥效，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2各組腦組織SOD、MDA水平 STZ可導(dǎo)致大鼠腦組織SOD活性降低、MDA含量上升(均P<0.01)，而各治療組均可不同程度提高SOD活性、降低MDA生成，其中石菖蒲揮發(fā)油高劑量組與模型組有顯著差異(P<0.01)，其藥效與腦復(fù)康組相當(dāng)(P>0.05)，中劑量、低劑量組也顯現(xiàn)出一定的改善SOD、MDA水平的作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，隨著石菖蒲揮發(fā)油劑量的增加，越有利于SOD、MDA水平的改善，顯現(xiàn)出一定的劑量依賴性，見(jiàn)表3。

表3 各組腦勻漿SOD、MDA水平

3 討 論

研究表明，STZ可通過(guò)破壞胰島素(Ins)/胰島素抵抗(IR)信號(hào)通路，降低大鼠腦內(nèi)的葡萄糖利用，引起腦能量代謝障礙造成認(rèn)知功能相關(guān)皮層的神經(jīng)細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙〔5～7〕，鑒于此，大鼠側(cè)腦室注射STZ模型可用于治療AD藥物的臨床前篩選。

本研究結(jié)果表明，模型組腦組織SOD活力顯著下降，抗自由基能力下降，MDA明顯高，其脂質(zhì)氧化程度加??；而石菖蒲揮發(fā)油組可顯著提高SOD 活力，具有抗自由基損傷作用，降低MDA含量，對(duì)抗脂質(zhì)氧化，尤其是石菖蒲揮發(fā)油高劑量組療效為優(yōu)。綜合大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，石菖蒲揮發(fā)油可以改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，且石菖蒲揮發(fā)油組藥效呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。與年齡老化有密切關(guān)系，氧自由基損傷理論是衰老的主要學(xué)說(shuō)之一，其中MDA可間接反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和老化程度，SOD則有助于清除氧自由基〔8〕，本實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)石菖蒲揮發(fā)油在行為學(xué)改變、對(duì)抗自由基氧化等方面有較好的治療效果，其作用機(jī)制很可能是通過(guò)影響腦組織中的SOD活性及MDA的含量，抑制氧自由基生成，達(dá)到保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

1Mosconi L，Mistur R，Switalski R，etal.FDG-PET changes in brain glucose metabolism from normal cognition to pathologically verified Alzheimer′s disease 〔J〕.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2009；36(5)：811-22.

2國(guó)家藥典編委會(huì).中國(guó)藥典(2010年版)一部〔M〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄63.

3李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006：254-8,260-1,292-3.

4溫中京，陳海委.中藥石菖蒲提取物對(duì)記憶障礙小鼠模型的改善作用研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009；27(10)：2203-5.

5曹續(xù)政，張黎明，周姍姍，等.側(cè)腦室注射鏈脲菌素制備阿爾茨海默病大鼠模型的研究〔J〕.沈陽(yáng)部隊(duì)醫(yī)藥，2006；19(5)：296-8.

6第五永長(zhǎng)，辛馥伶，李 敏，等.側(cè)腦室注射STZ對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬tau蛋白AD特異性位點(diǎn)磷酸化增加的影響〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010；8(8)：961-3.

7褚文政，劉 宏，孫永安，等.大鼠側(cè)腦室注射鏈脲酶素可導(dǎo)致與散發(fā)性阿爾茨海默病類似的腦葡萄糖代謝障礙及細(xì)胞內(nèi) Aβ1-40,Aβ1-42沉積增多〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2009；26(6)：680-3.

8艾 霞，高強(qiáng)強(qiáng).石菖蒲、遠(yuǎn)志對(duì)老年性癡呆模型小鼠腦組織超氧化物歧化酶和丙二醛的影響〔J〕.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013；15(6)：12-4.