范從紅 李 根 廖曉燕 辜定釬 曹麗麗

(成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610106)

卵巢癌早期發(fā)病隱匿，其中有70%的患者在確診時已經(jīng)是卵巢癌晚期，加上卵巢癌具有發(fā)展迅速、惡性程度高等特點，使得卵巢癌5年內(nèi)的生存率低于30%〔1〕。結腸癌轉(zhuǎn)移相關基因(MACC)1最初發(fā)現(xiàn)于結腸癌組織，其編碼的蛋白能夠促進結腸癌細胞的生長和侵襲〔2〕。后續(xù)研究表明，MACC1在宮頸癌、肝細胞癌、腎盂癌、子宮內(nèi)膜癌等癌癥組織中均過度表達〔3〕。抑制MACC1后癌細胞的侵襲能力受到影響，生長受到抑制〔4〕。本研究通過小RNA干擾技術干擾卵巢癌細胞中MACC1的表達，探討MACC1對卵巢癌細胞生長、遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1組織及細胞 卵巢癌細胞A2780由中國科技院細胞庫提供。選取2011年8月至2015年6月在成都市婦女兒童中心醫(yī)院確診并切除的卵巢癌患者卵巢癌組織及對應的癌旁組織各53例，年齡35～69歲，中位年齡53.87歲，手術前均沒有接受放化療，采集組織均經(jīng)過患者及家屬知情同意，并保存于液氮中。

1.2主要儀器及試劑 MACC1單克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于英國Abcam；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Transwell小室均購于北京鼎國生物技術有限公司；酶標儀購于美國Thermo。

1.3Western印跡檢測卵巢癌組織中MACC1的表達水平 取卵巢癌組織及對應的癌旁組織，剪碎后，加入冰預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞后，加入裂解液，勻漿器勻漿后，放在冰上裂解反應30 min。吸取蛋白上清液，取5 μl蛋白樣品，按照BCA蛋白定量檢測試劑盒說明書檢測蛋白樣品的濃度。剩下的蛋白樣品與5倍上樣緩沖液按照4∶1的比例混合后，放在沸水中煮沸5 min。每孔加入40 μl的變性蛋白樣品至聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣孔中，80 V電壓觀察溴酚藍進入濃縮膠和分離膠邊緣時，調(diào)整電壓至120 V直至溴酚藍進入底端。取出蛋白凝膠，4℃，90 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉在37℃封閉1.5 h后，加入一抗(1∶800)在4℃反應過夜后，再加入二抗(1∶2 000)中在37℃反應1.5 h，滴加顯色液，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白相對表達水平。

1.4細胞培養(yǎng)及細胞轉(zhuǎn)染 取出保存在液氮中的細胞，立即投入到37℃的水浴鍋中，期間進行不間斷的震蕩，觀察細胞完全融化后，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入DMEM培養(yǎng)基，混勻后，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 ml含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，種植到細胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞密度達到90%時，棄去細胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化液放在37℃消化細胞，1 000 r/min離心5 min后，棄酶消化液，加入細胞培養(yǎng)液懸浮細胞后，根據(jù)實驗要求按照不同比例接種到細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按照Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將MACC1 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，收集細胞，按照每106個細胞加入100 μl的含有苯甲基磺酰氟(PMSF)1 μl的細胞裂解液提取細胞總蛋白。Western印跡檢測細胞中MACC1表達水平，步驟參照1.3。

1.5MTT檢測細胞增殖 取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞，調(diào)整細胞濃度為每毫升含有3×105個細胞，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μl的細胞懸浮液，每組設置5個復孔，同時以不加入細胞只加入細胞培養(yǎng)液的組為空白組，培養(yǎng)24 h后，在細胞中加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，放在37℃條件下孵育反應4 h后，棄掉上清液，加入DMSO溶液150 μl，在低速搖床上震蕩混勻10 min。用酶標儀檢測492 nm的吸光度。計算細胞存活率。細胞存活率=100%×(轉(zhuǎn)染組吸光度-空白組吸光度)/(未轉(zhuǎn)染組吸光度-空白組吸光度)。

1.6細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞以4×105個/孔接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后，用200 μl的移液槍槍頭垂直在細胞中劃出一條細痕。棄掉細胞培養(yǎng)液，在細胞中加入PBS洗滌細胞3次，將劃出的細胞洗掉。加入含有2%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h。觀察細胞遷移距離，計算遷移率。遷移率=100%×(劃痕初始寬度-剩余寬度)/劃痕初始寬度。

1.7Transwell 小室檢測細胞侵襲能力 取出保存在-20℃的Matrigel，放在4℃解凍后，用不含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液按照9∶1的比例稀釋后，加入24孔Transwell小室中，每孔中加入20 μl，放置于37℃環(huán)境中濕化3 h。取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞A2780，調(diào)整細胞濃度為每毫升含有5×105個細胞。在實驗開始前用不含血清的細胞培養(yǎng)使細胞饑餓12 h。在Transwell小室的下室中加入500 μl的含有20%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，小室的上室加入200 μl的細胞懸浮液，放在37℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，甲醇固定后，蘇木素染色，隨機選擇5個視野在顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)目。

1.8Western印跡檢測細胞中MMP-2、MMP-9表達水平 轉(zhuǎn)染24 h后的卵巢癌細胞，提取細胞蛋白，參照1.3步驟檢測細胞中MMP-2、MMP-9表達水平，MMP-2、MMP-9一抗均稀釋800倍，二抗均稀釋2 000倍。

1.9統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1MACC1在卵巢癌組織中的表達水平 MACC1在癌旁組織和卵巢癌組織中的表達水平依次為0.35±0.03，1.12±0.08。MACC1在卵巢癌組織中高表達(P<0.05)。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染后細胞中MACC1表達水平檢測結果 未轉(zhuǎn)染組、siRNA control組、MACC1 siRNA組細胞中MACC1表達水平依次為：1.10±0.09，1.09±0.11，0.32±0.02；轉(zhuǎn)染MACC1 siRNA后的卵巢癌細胞中MACC1 表達水平降低(P<0.05)。MACC1 siRNA能夠成功干擾卵巢癌細胞中MACC1的表達。見圖2。

圖1 Western印跡檢測卵巢癌組織中MACC1表達水平

圖2 轉(zhuǎn)染后細胞中MACC1表達水平

2.3細胞增殖、遷移、侵襲檢測結果 siRNA control組細胞存活率、遷移率及侵襲細胞數(shù)目與未轉(zhuǎn)染組相比沒有明顯差異(P>0.05)。MACC1 siRNA組細胞存活率、遷移率及侵襲細胞數(shù)目均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 細胞存活率、遷移率及侵襲細胞數(shù)目

與未轉(zhuǎn)染組比較:1)P<0.01

2.4細胞中MMP-2、MMP-9表達水平檢測結果 未轉(zhuǎn)染組、siRNA control組、MACC1 siRNA組細胞中MMP-2表達水平依次為：0.75±0.06、0.75±0.05、0.06±0.01，MMP-9表達水平依次為：0.89±0.07、0.88±0.09、0.11±0.02。siRNA control組細胞中MMP-2、MMP-9表達水平與未轉(zhuǎn)染組相比沒有明顯差異(P>0.05)，MACC1 siRNA組細胞中MMP-2、MMP-9表達水平均明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組細胞中MMP-2、MMP-9表達水平

3 討 論

MACC1 最初發(fā)現(xiàn)于結腸癌原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶中，參與結腸癌細胞的遷移、增殖過程。近年來的研究表明，MACC1 在胰腺癌細胞CFPAC-1中表達上調(diào)，利用siRNA干擾MACC1表達后的胰腺癌細胞的增殖能力降低，遷移能力受到抑制〔5〕。后續(xù)的報道證實，MACC1在宮頸癌、肝癌、肺癌、胃癌等多種癌癥組織中過度表達，而抑制MACC1后的癌細胞生長、侵襲能力均受到影響〔6～8〕。本研究結果證實了卵巢癌組織中MACC1的過度表達，這與之前的研究結果一致。

癌細胞的生長、遷移和侵襲能力與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關。癌細胞失控生長后，逐漸破壞周圍組織結構，進而導致癌癥組織基底膜被破壞，癌細胞開始進入侵襲階段〔9〕。癌細胞能夠通過進入淋巴管或者微血管進入周圍組織中。癌細胞的侵襲和遷移能力受到多種調(diào)控因子的共同作用〔10〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的成員，具有降解細胞外基質(zhì)的作用〔11〕。有研究表明，MMP-2和MMP-9在肝癌、卵巢癌、舌鱗癌、胰腺癌等多種癌癥組織中表達異常升高，抑制MMP-2和MMP-9后的癌細胞遷移和侵襲能力明顯降低〔12〕。本研究進一步檢測了干擾MACC1后的卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，結果提示，干擾MACC1后，卵巢癌細胞的生長、遷移和侵襲能力均受到抑制作用。這為進一步體外實驗研究MACC1在卵巢癌中的作用奠定了基礎，為靶向MACC1基因治療卵巢癌提供了理論依據(jù)。

1王素琴，安紅軍，徐勝東，等.P38 MAPK 通路在老年卵巢癌化療藥物耐藥性產(chǎn)生中的作用〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(11)：2601-2.

2Ilm K，F(xiàn)uchs S，Mudduluru G，etal.MACC1 is post-transcriptionally regulated by miR-218 in colorectal cancer〔J〕.Oncotarget，2016；7(33)：53443-58.

3Guo B，Yao N，Gan H，etal.TGF beta1 upregulates the expression of MACC1 to promote invasion and metastasis of ovarian cancer〔J〕.Int J Clin Exp Med，2016；9(7)：12629-38.

4Schmid F，Wang Q，Huska MR，etal.SPON2，a newly identified target gene of MACC1，drives colorectal cancer metastasis in mice and is prognostic for colorectal cancer patient survival〔J〕.Oncogene，2016；35(46)：5942-52.

5Giannuzzo A，Saccomano M，Napp J，etal.Targeting of the P2X7 receptor in pancreatic cancer and stellate cells〔J〕.Int J Cancer，2016；139(11)：2540-52.

6羅 毅，劉路培，于 路.MACC1 基因下調(diào)對胃腺癌細胞的生長抑制作用〔J〕.天津醫(yī)藥，2015；43(8)：856-9.

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8許常娟，鄧丹玲，丁彥青，等.miRNA-143 靶向 MACC1 抑制宮頸癌細胞侵襲〔J〕.中國腫瘤臨床，2015；42(18)：900-5.

9Jiang Q，He M，Ma MT，etal.MicroRNA-148a inhibits breast cancer migration and invasion by directly targeting WNT-1〔J〕.Oncol Rep，2016；35(3)：1425-32.

10Huang J，Wang B，Hui K，etal.miR-92b targets DAB2IP to promote EMT in bladder cancer migration and invasion〔J〕.Oncol Rep，2016；36(3)：1693-701.

11Aroui S，Najlaoui F，Chtourou Y，etal.Naringin inhibits the invasion and migration of human glioblastoma cell via downregulation of MMP-2 and MMP-9 expression and inactivation of p38 signaling pathway〔J〕.Tumor Biol，2016；37(3)：3831-9.

12Zou M，Zhang X，Xu C.IL6-induced metastasis modulators p-STAT3，MMP-2 and MMP-9 are targets of 3，3′-diindolylmethane in ovarian cancer cells〔J〕.Cell Oncol，2016；39(1)：47-57.