朱大冕 胡代玉 劉潔 逄宇 羅明 沈靜 陳林

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是目前被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病治療的4種一線藥物之一，其可以抑制酸性環(huán)境中處于半休眠期的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)。PZA是一種前藥，需要MTB的pncA基因(蛋白編碼序列為561 bp)編碼的吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase)將其轉(zhuǎn)化為酸性形式的吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)才能發(fā)揮作用[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，75%的PZA耐藥MTB存在pncA突變[2-3]。PZA的活性成分POA通過抑制核糖體蛋白R(shí)psA 的活性來抑制MTB的生長[4]。rpsA基因的超量表達(dá)使得MTB對(duì)PZA的最小抑菌濃度升高了5倍，并且在少數(shù)PZA低度耐藥株中存在rpsA基因的突變。因此，筆者對(duì)重慶地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-MTB)pncA基因和rpsA基因的突變特征及其與PZA耐藥性的相關(guān)性進(jìn)行研究，以期望建立快速檢測(cè)MTB的PZA耐藥性的分子診斷學(xué)方法[5]。

材料和方法

1.標(biāo)本來源：收集2014年11月至2016年2月重慶市結(jié)核病防治所“MTB耐多藥項(xiàng)目”中所屬39個(gè)區(qū)(縣)的133株MDR-MTB臨床分離菌株。MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv來自中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。

2.試劑：(1)1%標(biāo)準(zhǔn)比例法固體藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)所采用的含藥及對(duì)照培養(yǎng)基，菌種鑒定所用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)培養(yǎng)基，均購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。含藥培養(yǎng)基的終濃度分別為：異煙肼(INH)0.2 μg/ml，利福平(RFP)4 μg/ml，鏈霉素(Sm)2 μg/ml，乙胺丁醇(EMB)40 μg/ml，氧氟沙星(Ofx)2 μg/ml，卡那霉素(Km)30 μg/ml，卷曲霉素(Cm)40 μg/ml，丙硫異煙胺(Pto)40 μg/ml，對(duì)氨基水楊酸(PAS)1 μg/ml，阿米卡星(Am)30 μg/ml。(2)PZA液體藥敏檢測(cè)采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)，采用BACTEC MGIT 960 PZA藥敏試劑盒(包括PZA藥物和PZA添加劑)，液體培養(yǎng)基為改良Middlebrook 7H9(pH=5.9)，其中PZA含量100 μg/ml。

3. 1%標(biāo)準(zhǔn)比例法固體藥敏試驗(yàn)及鑒定：選用臨床初次分離的菌株(出現(xiàn)肉眼可見菌落后2～3周的新鮮菌落)，用滅菌的接種環(huán)挑取改良羅氏培養(yǎng)基斜面上的菌落置于磨菌瓶中，渦旋振蕩10～20 s，以生理鹽水配成1麥?zhǔn)蠞舛?，并用生理鹽水稀釋至濃度為10-2mg/ml、10-4mg/ml的菌懸液。用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1滿環(huán)(0.01 ml)稀釋好的菌懸液分別接種于對(duì)照和含藥培養(yǎng)基，直立放置，37 ℃培養(yǎng)，待菌落長出時(shí)觀察結(jié)果，根據(jù)耐藥百分比判讀：耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基生長的菌落數(shù))×100%，若耐藥百分比大于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。菌種鑒定：操作同固體藥敏實(shí)驗(yàn)，用生理鹽水稀釋至濃度為10-1mg/ml的菌懸液，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1滿環(huán)(0.01 ml)稀釋好的菌懸液接種于PNB和TCH培養(yǎng)基。

4. BACTEC MGIT 960系統(tǒng)法：每株菌需準(zhǔn)備2支MGIT 960培養(yǎng)管(1管為生長對(duì)照管，1管為加藥管)，每管加0.8 ml的PZA添加劑，在標(biāo)記有PZA的培養(yǎng)管加入100 μl的PZA藥物。配置菌懸液同比例法，調(diào)節(jié)濁度為0.5麥?zhǔn)蠞舛龋迫?.5 ml此菌懸液至4.5 ml生理鹽水，做1∶10稀釋，混勻。加0.5 ml稀釋后的菌液至生長對(duì)照管，混勻。在PZA藥物管中加入0.5 ml未稀釋的菌液，混勻。將準(zhǔn)備好的MGIT管放入標(biāo)記好的藥敏試驗(yàn)試管架，并按照放管程序放入BACTE MGIT 960儀器，選擇PZA藥敏試驗(yàn)試管架。MGIT 960儀器會(huì)在4～13 d內(nèi)，根據(jù)生長單位(growth unit)值，自動(dòng)報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

5. DNA提?。翰捎媒臃N環(huán)(10 μl)從羅氏培養(yǎng)基斜面刮取適量菌苔至螺旋口離心管，加入0.5 ml去離子水，振蕩混勻，85 ℃金屬浴30 min滅活；12 000×g離心5 min，棄上清；加入0.5 ml 1×TE緩沖液重懸，100 ℃金屬浴20 min；12 000×g離心5 min，吸取上清作為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6. 基因測(cè)序：耐藥相關(guān)基因測(cè)序使用引物見表1。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系為：25 μl 2×Master MIX，1 μl上游引物，1 μl下游引物，4 μl的DNA模板，19 μl去離子水。耐藥基因pncA的PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，3個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。耐藥基因rpsA的PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 35 min，應(yīng)用凝膠成像儀觀察并確保成功擴(kuò)增后，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。其測(cè)序結(jié)果采用Mega 6.0軟件進(jìn)行比對(duì)和突變分析。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用描述性統(tǒng)計(jì)分析方法，計(jì)算MDR-MTB 菌株P(guān)ZA耐藥率，不同特征人群分離的MDR-MTB 菌株P(guān)ZA耐藥構(gòu)成比，以及耐藥基因突變率；采用單因素分析方法(卡方檢驗(yàn))，分析MDR-MTB 菌株P(guān)ZA耐藥影響因素；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.藥敏試驗(yàn)結(jié)果：133株MDR-MTB菌株中83株 PZA耐藥、50株P(guān)ZA敏感，耐藥率為 62.4%。MDR-MTB菌株中包含38株前廣泛耐藥結(jié)核和17株廣泛耐藥結(jié)核。菌株來源患者中，包括男80例(60.2%)，女53例(39.8%)；年齡19～76歲，中位年齡42(31～53)歲。初治患者49例，占36.8%，復(fù)治患者84例，占63.2%，見表2。

2.耐藥基因測(cè)序分析結(jié)果：(1)pncA基因突變結(jié)果：MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv未檢測(cè)到pncA突變。對(duì)pncA基因及其上游調(diào)控序列進(jìn)行測(cè)序，序列分析顯示50株P(guān)ZA敏感株中4株發(fā)生pncA基因突變，突變率為8.0%；83株P(guān)ZA耐藥株中73株發(fā)生pncA基因突變，突變率為87.9%；PZA耐藥株的突變率明顯高于PZA敏感株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=81.82，P=0.000)。PZA耐藥株中共有48種突變類型，突變形式包括堿基置換(55株)、移碼突變(16株)、整碼突變(2株)。堿基突變區(qū)域分別集中在位點(diǎn)20～40(10株)、136～146(6株)、185～226(10株)、392～408(15株)區(qū)域。9株在395位堿基發(fā)生G→A的單堿基突變，導(dǎo)致氨基酸由甘氨酸→天冬氨酸的改變；5株在185位堿基發(fā)生C→T單堿基突變，氨基酸改變?yōu)楦彼帷涟彼幔?株在啟動(dòng)子區(qū)-11位堿基發(fā)生A→G突變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)有18種新的突變類型，包括7種點(diǎn)突變(T2C、T37G、T94G、C206T、G319A、C437T、T488C)，8種插入突變(52插入GCC、130插入C、139插入CA、232插入C、243插入T、288插入A、393插入GGT、408插入CA),3種缺失突變(341缺失ACGCC、342缺失GCCAC、376缺失GATGAGGTC)，見表3。PZA敏感株中4株發(fā)生了pncA基因突變，包括C184A、C185A、C200G、G461A，見表4。(2)rpsA基因突變結(jié)果：對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與NCBI H37Rv標(biāo)準(zhǔn)序列做比對(duì)，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv未檢測(cè)到rpsA基因突變，133株MDR-MTB菌株未發(fā)現(xiàn)有rpsA基因突變。

表1 耐藥相關(guān)基因測(cè)序使用引物

表2 各因素對(duì)133株MDR-MTB菌株P(guān)ZA耐藥的影響分析

表3 對(duì)PZA耐藥的MDR-MTB菌株pncA基因突變情況

表4 PZA敏感的MDR-MTB菌株pncA基因突變情況

討 論

本研究通過對(duì)重慶地區(qū)133株MDR-MTB進(jìn)行檢測(cè)及相關(guān)資料分析，發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)MDR-MTB的PZA耐藥率較高(62.4%)，復(fù)治是PZA耐藥的危險(xiǎn)因素之一。其中，PZA耐藥株pncA突變率為87.9%，明顯高于PZA敏感株pncA突變率(8.0%)，且PZA耐藥株中未發(fā)現(xiàn)rpsA基因突變，此結(jié)果提示MDR-MTB菌株P(guān)ZA耐藥與pncA突變相關(guān)。

目前，重慶地區(qū)并未常規(guī)開展MTB的PZA藥敏試驗(yàn)，本地區(qū)PZA耐藥情況未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，重慶地區(qū)MDR-MTB菌株對(duì)PZA有較高耐藥率，這為臨床用藥尤其對(duì)于耐多藥結(jié)核病患者用藥有很大的指導(dǎo)作用。筆者對(duì)患者資料進(jìn)行單因素分析顯示，復(fù)治是PZA耐藥的危險(xiǎn)因素，這可能與復(fù)治患者中的耐多藥結(jié)核病患者比例高有關(guān)。盡管納入的患者中男性構(gòu)成比高于女性，且30～59歲的人數(shù)最多，但未發(fā)現(xiàn)不同性別和年齡患者的MDR-MTB菌株對(duì)PZA耐藥是否有影響。

研究證實(shí)，PZase的失活是MTB對(duì)PZA產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制[6-7]，而pncA作為PZase的編碼基因，其突變會(huì)使MTB的PZase活性降低或失活，從而使MTB產(chǎn)生對(duì)PZA的耐藥性。本研究中 PZA耐藥株pncA突變率為87.9%，與國外文獻(xiàn)報(bào)道的pncA基因突變率(69.0%～98.8%)相似[1，8-11]，但高于國內(nèi)近幾年其他地區(qū)的報(bào)道結(jié)果[12-15]。PZA耐藥株中共有47種突變類型，主要以堿基置換為主。9株在395位堿基發(fā)生G→A的單堿基突變，這是本研究中最為常見的突變類型，也可能是重慶地區(qū)MDR-MTB菌株pncA基因特征性突變位點(diǎn)。但是，該突變導(dǎo)致PZase的改變從而導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，需進(jìn)一步研究。4株菌株在啟動(dòng)子區(qū)-11位堿基發(fā)生A→G突變，也是其他國家報(bào)道過的突變類型[16-17]，這提示pncA上游調(diào)控序列的改變同樣會(huì)影響PZase的活性從而導(dǎo)致PZA耐藥。堿基突變所集中的4個(gè)區(qū)域?yàn)槲稽c(diǎn)20～40、136～146、185～226、392～408，這些集中區(qū)域與以往的報(bào)道有所不同[1,18]；對(duì)PZA耐藥菌株的pncA基因中發(fā)現(xiàn)有18種此前未報(bào)道的新突變類型，分別發(fā)生在19株菌株中[19-24]，這些研究結(jié)果提示pncA基因突變具有多態(tài)性和地區(qū)差異性。因此，了解本地區(qū)MDR-MTB菌株pncA基因突變的特征對(duì)于PZA耐藥分子生物學(xué)診斷方法的研發(fā)和應(yīng)用非常必要。

PZA耐藥株有10株均未檢測(cè)到pncA基因或rpsA基因突變，除外PZA藥敏試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確的因素外，提示可能還存在非pncA基因和rpsA基因突變的其他耐藥機(jī)制[25-26]。PZA耐藥株pncA基因突變位點(diǎn)比較分散，從核苷酸-11～515位均有出現(xiàn)，隨機(jī)散布在整個(gè)pncA基因上包括調(diào)控序列，無固定的突變位點(diǎn)，這與其他研究結(jié)果一致[1,27]，提示pncA基因突變導(dǎo)致的任何一個(gè)氨基酸改變都可能影響PZase的活性，不能將PZA轉(zhuǎn)化成有活性的POA。

本研究中，PZA敏感株中有少量發(fā)生pncA基因突變。首先，PZA藥敏試驗(yàn)所采用的MGIT 960系統(tǒng)在做PZA藥敏試驗(yàn)時(shí)需用特殊的酸性培養(yǎng)基，臨床分離的菌株在酸性環(huán)境下生長會(huì)受到抑制，這就有可能得到錯(cuò)誤的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[28]。其次，PZA敏感株中發(fā)生的突變與耐藥株的突變并不相同，這也提示這些位點(diǎn)的某些突變類型不能對(duì)PZase產(chǎn)生影響或是不會(huì)使PZase失去活性。

研究顯示，由rpsA基因編碼的核糖體蛋白質(zhì)S1(RpsA)是POA的一個(gè)作用靶蛋白，是與MTB菌株對(duì)PZA耐藥有關(guān)的蛋白質(zhì)[4]。此后該結(jié)論也得到Simons等[29]的證實(shí)。但本次研究中，133株MDR-MTB并未發(fā)現(xiàn)有rpsA基因突變，這可能與菌株數(shù)量較少有關(guān)，但仍提示該基因的突變并不是PZA耐藥的常見機(jī)制，這與國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道相符合[30-32]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)MDR-MTB中對(duì)PZA的耐藥率較高，且pncA基因突變是重慶地區(qū)MTB對(duì)PZA耐藥的主要機(jī)制，可通過對(duì)pncA基因進(jìn)行序列分析對(duì)重慶地區(qū)PZA耐藥株進(jìn)行快速篩查，及時(shí)為臨床治療提供參考。

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