史祥 尹洪云 沙巍 肖和平

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性是診斷結(jié)核病的金標準，但羅氏培養(yǎng)法需1～2個月得出結(jié)果，快速培養(yǎng)法平均需要18 d，因此，臨床亟需能夠盡快得出診斷結(jié)果的方法。筆者回顧分析2014年11月至2015年10月在上海市肺科醫(yī)院住院的980例患者的臨床資料，評價采用外周血結(jié)核感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)、痰液結(jié)核分枝桿菌實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)，以及血清結(jié)核抗體(TB-Ab)檢測對結(jié)核病的臨床診斷價值。

對象和方法

1.對象：選取上海市肺科醫(yī)院2014年11月至2015年10月期間確診為肺結(jié)核的住院患者作為肺結(jié)核組，共689例，平均年齡(41.77±18.60)歲；其中，痰涂片結(jié)核分枝桿菌陽性者179例，陰性者510例；任何標本(痰液、胸腔積液、穿刺液、活檢標本、氣管鏡沖洗液等)涂片和(或)培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性者310例，陰性者379例；初治肺結(jié)核596例，并發(fā)肺外結(jié)核者278例。選取同時期上海市肺科醫(yī)院住院的肺部非結(jié)核性疾病患者作為非肺結(jié)核組，共291例，平均年齡(53.69±16.91)歲，包括肺部惡性腫瘤68例，普通細菌性肺炎135例，支氣管擴張伴感染32例，肺真菌病11例，其他呼吸系統(tǒng)疾病45例(包括間質(zhì)性肺病、結(jié)節(jié)病等)。腫瘤患者均經(jīng)病理學、細胞學證實，其他疾病根據(jù)患者臨床癥狀體征、常規(guī)化驗檢查、影像學檢查表現(xiàn)及臨床治療療效等證實。兩組均已剔除細菌學培養(yǎng)證實為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者；所有患者均無人類免疫缺陷病毒(HIV)感染或免疫抑制劑藥物治療史，無妊娠期婦女。

2.肺結(jié)核診斷標準：結(jié)核病的診斷參照文獻[1]。胸部CT掃描顯示的征象支持肺結(jié)核，痰涂片抗酸桿菌(acid-fast bacilli，AFB)陽性，抗結(jié)核藥物治療有效。胸部CT掃描顯示的征象支持肺結(jié)核，痰涂片AFB陰性，但具備以下其一者：痰液以外任何標本涂片或培養(yǎng)AFB陽性、痰液培養(yǎng)AFB陽性、診斷性抗結(jié)核藥物治療2個月后行胸部CT掃描復查證實有效。

3.全血T-SPOT.TB檢測：采用上海復星長征科學有限公司生產(chǎn)的試劑盒。使用肝素鋰抗凝真空采血管抽取患者靜脈血5 ml，18～25 ℃儲存，4 h內(nèi)送檢。外周血單個核細胞的計數(shù)采用顯微鏡下人工計數(shù)法。根據(jù)抗原A(早期分泌靶抗原6)和抗原B(培養(yǎng)濾液蛋白10)測試孔的反應判斷結(jié)果：(1)陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個，測試孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥6，判斷為陽性；(2)陰性對照孔斑點數(shù)≥6，抗原A或抗原B斑點數(shù)≥2倍無反應性對照孔斑點數(shù)，判斷為陽性。

4.SAT檢測：采用上海仁度生物科技有限公司生產(chǎn)的SAT-TB檢測試劑盒，根據(jù)說明書進行操作。將預處理的標本按1∶100的比例用TB稀釋液(采用焦碳酸二乙酯處理過的無菌水配制的10 mmol/L檸檬酸鈉)進行稀釋，放入超聲波清洗器中進行超聲處理15 min，超聲功率為300 W。超聲處理結(jié)束后，取出2 μl處理物加入30 μl擴增檢測液(含40 mmol/L的Tris-HCL緩沖液，pH=8.1)中，開啟恒溫熒光檢測儀器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，按儀器操作手冊設(shè)定反應程序，熒光素通道設(shè)定為6-羧基熒光素(FAM)42 ℃ 1 min，40個循環(huán)；熒光信號收集每分鐘進行1次，共檢測40次。反應結(jié)束后置于恒溫混勻儀(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)中42 ℃保溫5 min，同時將SAT酶液(含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶各2000 U)也預熱到42 ℃加入反應管，快速轉(zhuǎn)至恒溫熒光檢測儀上進行檢測。

5.TB-Ab檢測：采用上海奧普生物醫(yī)藥公司的結(jié)核分枝桿菌抗體膠體金法診斷試劑盒，應用斑點免疫金滲濾法。

6.統(tǒng)計學分析：應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。以肺結(jié)核臨床診斷為金標準，分別評價T-SPOT.TB、SAT及TB-Ab檢測單獨及聯(lián)合檢測對肺結(jié)核診斷效能。各項指標計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。同時，繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評價各方法單獨及聯(lián)合檢測對肺結(jié)核診斷效能，計算曲線下面積(AUC)。

結(jié) 果

1.痰液SAT檢測結(jié)果：共有524例患者行痰液SAT檢測，其中肺結(jié)核組437例，非肺結(jié)核組87例。以臨床診斷為金標準，SAT檢測的敏感度為30.43%(133/437)，特異度為100.00%(87/87)，陽性預測值為100.00%(133/133)，陰性預測值為77.75%(304/391)。

2.外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果：共有936例患者行T-SPOT.TB檢測，其中肺結(jié)核組654例，非肺結(jié)核組282例。以臨床診斷為金標準，T-SPOT.TB檢測敏感度為90.67%(593/654)，特異度為68.09%(192/282)，陽性預測值為86.82%(593/683)，陰性預測值為75.89%(192/253)。

3.血清TB-Ab檢測結(jié)果：966例患者行血清TB-Ab檢測，其中肺結(jié)核組678例，非肺結(jié)核組288例。以臨床診斷為金標準，TB-Ab檢測敏感度為43.95%(298/678)，特異度為78.82%(227/288)，陽性預測值為83.01%(298/359)，陰性預測值為37.40%(227/607)。

4.聯(lián)合檢測的診斷價值：以肺結(jié)核臨床診斷為金標準，評價各方法聯(lián)合檢測的診斷效能，任一種檢測方法結(jié)果陽性則診斷為肺結(jié)核，聯(lián)合檢測結(jié)果均為陰性時，判斷為陰性。3種方法聯(lián)合檢測的敏感度為93.14%(285/306)，特異度為53.41%(47/88)；TB-Ab和SAT聯(lián)合檢測的敏感度為55.48%(238/429)，特異度為87.64%(78/89)；T-SPOT.TB和TB-Ab聯(lián)合檢測的敏感度為92.83%(440/474)，特異度為52.11%(148/284)； T-SPOT.TB和SAT聯(lián)合檢測的敏感度為88.89%(264/297)，特異度為61.80%(55/89)，見表1。654例肺結(jié)核患者痰涂片抗酸桿菌檢測陽性197例，敏感度為30.12%(197/654)；所有非肺結(jié)核患者痰涂片抗酸桿菌檢測均為陰性。繪制ROC曲線評價外周血T-SPOT.TB、痰液SAT、血清TB-Ab檢測診斷肺結(jié)核的價值，各檢測方法測得的曲線下面積(AUC)分別為：0.798、0.652、0.614。T-SPOT.TB+SAT+TB-Ab、T-SPOT.TB+SAT、T-SPOT.TB+TB-Ab、SAT+TB-Ab檢測的AUC分別為：0.865、0.826、0.843、0.732。

討 論

早診斷和早治療對于結(jié)核病防治至關(guān)重要，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比，SAT法檢測各類臨床標本中的結(jié)核分枝桿菌具有快速和敏感度高的優(yōu)勢[2-5]。van der Vliet等[6]在1994年通過體外擴增16S rRNA進行分枝桿菌活性檢測和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。試驗證實RNA分子半衰期短，是結(jié)核分枝桿菌活菌的標志，可直接檢測細菌活性，突出了活菌檢測的價值和臨床意義[2-3]，并且自然條件下RNA易降解，標本不易被污染。痰液SAT檢測技術(shù)是針對結(jié)核分枝桿菌特有的16S RNA或DNA進行擴增，特異度高，不易出現(xiàn)假陽性。van der Vliet等[6]報道，患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌菌株可能為沒有代謝活性的死菌，SAT法可用于鑒定痰液中結(jié)核分枝桿菌是否為活菌，幫助觀察療效。倪麗麗等[7]提出，SAT法擴增過程敏感度較高，當標本中結(jié)核分枝桿菌活力較差或存在擴增抑制因子，或者核酸抽提效率不高時可能出現(xiàn)假陰性，應在SAT-TB法檢測體系中加入質(zhì)控擴增體系，以更加有效地判斷SAT-TB法陰性檢測結(jié)果。當標本中菌量較少或細菌活力較差而導致其在培養(yǎng)基中無法生長時，因活菌中16S RNA拷貝數(shù)較DNA的拷貝數(shù)高，使得SAT-TB檢測敏感度較以DNA為檢測靶標的核酸擴增PCR熒光體外檢測法的敏感度更高。本次研究結(jié)果顯示，以肺結(jié)核臨床診斷作為金標準，SAT-TB法的敏感度為30.43%，特異度為100.00%，陽性預測值為100.00%，陰性預測值為77.75%，單獨用于診斷肺結(jié)核時，具有一定的參考價值(AUC=0.652)。本次研究結(jié)果中，SAT-TB檢測敏感度低于羅賢等[8](59%)和Cui等[9](67.6%)研究結(jié)果，可能與患者選擇、送檢痰液標本質(zhì)量與存放送檢條件限制等有關(guān)。

表1 3種檢測技術(shù)不同聯(lián)合檢測方式對肺結(jié)核的診斷效能

注聯(lián)合檢測時任一種方法檢測結(jié)果陽性則判斷為陽性，聯(lián)合檢測結(jié)果均為陰性時判斷為陰性

T-SPOT.TB可檢測外周血中結(jié)核分枝桿菌特異性釋放γ干擾素的T細胞，與卡介苗無交叉免疫反應，但無法區(qū)分活動性結(jié)核病還是潛伏感染[10]。本研究結(jié)果顯示，以肺結(jié)核臨床診斷為金標準，T-SPOT.TB檢測敏感度最高(90.67%)，但特異度(68.09%)較SAT(100.00%)低，陽性預測值為86.82%，陰性預測值為75.89%；與潘麗萍等[11]的研究結(jié)果相近，略高于Metcalfe等[12]的Meta分析結(jié)果，即T-SPOT.TB在中低收入國家診斷肺結(jié)核的綜合敏感度為83%(95%CI：63%～94%)，綜合特異度為61%(95%CI：40%～79%)。ROC曲線分析顯示T-SPOT.TB檢測輔助診斷肺結(jié)核價值較高(AUC=0.798)。潘麗萍等[11]也提出，相對于老年肺結(jié)核患者，T-SPOT.TB對中青年肺結(jié)核患者有較好的輔助診斷價值。在其他研究中，F(xiàn)erguson等[13]、Escalante等[14]、萬榮等[15]等提出，T-SPOT.TB在做血液透析患者、風濕性疾病患者，以及老年患者中篩查近期結(jié)核感染的敏感度、特異度、診斷符合率也都高于TB-Ab檢測結(jié)果。

血清TB-Ab檢測是目前臨床開展最早、應用最廣泛的快速檢測方法。以肺結(jié)核臨床診斷為金標準，血清TB-Ab檢測敏感度較低(43.95%)，特異度為78.82%，與SAT檢測及T-SPOT.TB檢測比較，其敏感度和特異度均不高。

筆者進一步分析了SAT、T-SPOT.TB、TB-Ab等檢測方法不同組合方式聯(lián)合檢測結(jié)核病的診斷價值。結(jié)果顯示，敏感度及特異度均有不同程度提高，3種方法聯(lián)合檢測時診斷價值最高(AUC=0.865)，T-SPOT.TB聯(lián)合TB-Ab檢測的診斷價值次之(AUC=0.843)。

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